Rev. Agrotec. Amaz. 3(2), e555, doi: 10.51252/raa.v3i2.555
Artículo Original
Original Article
Jul-Dic, 2023
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e-ISSN: 2710-0510
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Condiciones de fermentación y secado en las características
físico químicas del cacao (Theobroma cacao L.) Cultivar CCN
51
Fermentation and drying conditions in the physical-chemical characteristics of
cocoa (Theobroma cacao L.) Cultivar CCN 51
Chávez-Salazar, Angel1* Guevara-Pérez, Américo2
Encina-Zelada, Christian2 Vidaurre-Rojas, Pierre1
Muñoz-Delgado, Victor1
1Universidad Nacional de San Martín, Tarapoto, Perú
2Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú
Recibido: 01 Abr. 2023 | Aceptado: 23 Jun. 2023 | Publicado: 10 Jul. 2023
Autor de correspondencia*: achavez@unsm.edu.pe
Cómo citar este artículo: Chávez-Salazar, A., Guevara-Pérez, A., Encina-Zelada, C., Vidaurre-Rojas, P. & Muñoz-Delgado, V. (2023).
Condiciones de fermentación y secado en las características físico químicas del cacao (Theobroma cacao L.) Cultivar CCN 51. Revista
Agrotecnológica Amazónica, 3(2), e555. https://doi.org/10.51252/raa.v3i2.555
RESUMEN
El estudio evaluó el efecto de la altura del cajón de fermentación y los métodos de secado en las características
fisicoquímicas del cacao CCN 51. Se procesaron mazorcas de cacao mediante cajón de fermentación y se secaron
al sol, con un secador solar o con flujo de aire caliente. Se encontró que la menor degradación de polifenoles
(16,9%) se produjo a 1m de altura y la menor pérdida de antocianinas (42,4%) a 0,20m. Después de 96 horas de
fermentación, las muestras alcanzaron una temperatura promedio de 52,3°C y un pH final de 4,31. Los sólidos
solubles disminuyeron de 19,5 a 0 °Brix después de tres días de fermentación. Respecto a los métodos de secado,
el flujo de aire caliente produjo el menor porcentaje de degradación de polifenoles (29,9%) y antocianinas
(65,1%). Las muestras secadas al sol y las secadas con el secador solar presentaron diferencias significativas en la
degradación de polifenoles. El método de secado seleccionado fue con flujo de aire caliente, y las muestras
presentaron las siguientes características: 8,13(g EAG/100g de m. s.), 0,64 (mg cianidina-3-glucosido/g de m. s.),
0,32(g. de ácido acético /100g de m. s.).
Palabras clave: cajón de fermentación, Colección Castro Naranjal 51, métodos de secado, polifenoles
ABSTRACT
The study evaluated the effect of the height of the fermentation box and the drying methods on the
physicochemical characteristics of CCN 51 cocoa. Cocoa pods were processed through the fermentation box and
dried in the sun, with a solar dryer or with air flow. hot. It was found that the least degradation of polyphenols
(16.9%) occurred at 1m height and the least loss of anthocyanins (42.4%) at 0.20m. After 96 hours of fermentation,
the samples reached an average temperature of 52.3°C and a final pH of 4.31. The soluble solids decreased from
19.5 to 0 °Brix after three days of fermentation. Regarding the drying methods, the flow of hot air produced the
lowest percentage of degradation of polyphenols (29.9%) and anthocyanins (65.1%). The samples dried in the sun
and those dried with the solar dryer presented significant differences in the degradation of polyphenols. The
selected drying method was with hot air flow, and the samples presented the following characteristics: 8.13 (g
EAG/100g of m. s.), 0.64 (mg cyanidin-3-glucoside/g of m. s.), 0. 32(g. of acetic acid /100g of m. s.).
Keywords: fermentation drawer, Castro Naranjal Collection 51, drying methods, polyphenols
Chávez-Salazar, A. et al.
2 Rev. Agrotec. Amaz. 3(2): e555; (jun-dic, 2023). e-ISSN: 2710-0510
1. INTRODUCCIÓN
El cacao (Theobroma cacao L.) es un cultivo tropical que ha jugado un papel importante en la economía y
cultura de muchos países durante siglos (Lenou Nkouedjo et al., 2020). La planta es originaria de la cuenca
del Amazonas (Pérez et al., 2021). Sin embargo, a la actualidad, el cacao se cultiva principalmente en África
occidental, que representa más del 70% de la producción mundial (Teye & Nikoi, 2022). Otros productores
importantes incluyen América del Sur, el sudeste asiático y América Central (Keller et al., 2022).
Con respecto al mercado mundial, el cacao es altamente competitivo y está en constante evolución (Kasmin
& Nursalam, 2019). La demanda de productos derivados del cacao y el chocolate continúa en aumento,
impulsada por la creciente conciencia de los consumidores acerca de los beneficios para la salud del cacao,
así como por la popularidad del chocolate premium y artesanal (Li, 2020). Sin embargo, la industria
también se enfrenta a desafíos significativos, tales como el cambio climático, las plagas y enfermedades, así
como problemas relacionados con la sostenibilidad y el abastecimiento ético (Suh & Molua, 2022) .
En ese sentido, el cultivo del cacao tiene un impacto significativo en las distintas economías productoras,
proporcionando ingresos y empleo a millones de personas (López Cuadra et al., 2020). En Perú, la
producción de cacao en grano ha experimentado un crecimiento constante en los últimos diez años, con
una tasa de crecimiento promedio anual del 12,6% (Guzmán-Bautista & Chire-Fajardo, 2019). En el país, se
cultivan tres tipos de cacao: trinitario (53,3%), forastero amazónico (37,3%) y criollo (9,4%). Las cinco
regiones más destacadas en términos de producción son San Martín, Junín, Ucayali, Huánuco y Cusco, las
cuales representan aproximadamente el 84% del total de la producción del país (MINAGRI, 2022).
La región San Martín se destaca como el principal productor de cacao, con una participación del 35,6% y
una producción de 48,4 mil toneladas. Además, cuenta con un área cultivada de 65,184 hectáreas, donde el
80% está dedicado al cultivo del cacao de la variedad CCN 51. Esta elección se debe a su alto rendimiento,
que oscila entre 2,500 y 3,000 kg/ha/año en las zonas de Tocache y Uchiza (MINAGRI, 2022). A pesar de
ello, esta variedad de grano no se considera de calidad superior en términos de aroma, aunque su contenido
de aceites y grasas es adecuado para la producción de manteca (Andrade et al., 2019).
Para ello, la fermentación de las almendras de cacao puede considerarse principalmente como un proceso
de curado para estabilizar las almendras frescas a través de la degradación microbiana del mucilago
firmemente adherido y perecedera a través del secado (García-Rincón et al., 2021). Se produce diversos
cambios químicos y bioquímicos que son necesarios para formar el aroma y los precursores del aroma que
se producirán en el proceso de tostado. Durante el proceso de secado convencional del cacao (secado al
sol), las almendras de cacao son secados hasta obtener el contenido de humedad deseado (C. O. Álvarez et
al., 2022). Pero, el secado degrada los polifenoles en los granos de cacao a través de una reacción compleja
conocida como dorado y también debido al efecto térmico.
Por lo expuesto, decidimos realizar la presente investigación planteando los siguientes objetivos: (1)
evaluar el efecto de las condiciones de fermentación; sobre la variación de los polifenoles totales,
antocianinas, color y pH en la almendra de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51. Y (2) evaluar el
efecto del método de secado (directo al sol, cámara de secado al sol y con aire caliente) sobre la variación
de polifenoles totales, antocianinas, color y pH en la almendra de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN
51.
2. REVISIÓN DE LA LITERATURA
2.1 Origen y distribución de la materia prima
El cacao (Theobroma cacao L.) es una especie endémica de América del Sur, y su centro de origen se
encuentra en la región que abarca las cuencas de los ríos Caquetá, Putumayo y Napo, los cuales son
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afluentes del río Amazonas (Pérez et al., 2021). En la cuenca amazónica, esta especie se distribuye en países
como Bolivia, Brasil, Colombia, Venezuela, Surinam y Guyana. En la selva peruana, el cacao se cultiva en
diversos departamentos, entre ellos Loreto, San Martín, Ucayali, Huánuco, Junín, Cerro de Pasco, Madre de
Dios, Cuzco, Amazonas y Ayacucho.
2.2 Composición químico proximal de las almendras de cacao
En los granos de cacao fermentados y secos de África Occidental, el contenido de grasa oscila entre el 56 y
el 58%, y la mayoría de los cacao Forastero caen entre el 55 y el 59% (E. O. Afoakwa et al., 2008; Reineccius
et al., 1972; Rohan, 1963; Wood & Lass, 1985). En la Tabla 1 se presenta el análisis proximal de las
almendras de cacao frescas y fermentadas.
Tabla 1.
Composición proximal (base seca) de almendras de cacao frescas y en proceso de fermentación
Horas de
fermentación
Humedad
Ceniza
Proteína cruda
Grasa cruda
Fibra dietaría
0
57,85±0,02a
5,73±0,01a
12,46±0,03a
54,45±0,09e
2,65±0,35g
24
55,13±0,01b
5,13±0,00b
11,45±0,00e
54,92±0,12bc
3,18±0,38f
48
52,00±0,01c
4,74±0,06d
11,94±0,06c
54,76±0,15cd
3,64±0,29e
72
49,31±0,08d
4,98±0,01c
11,76±0,05d
3,91±0,03f
3,75±0,25e
96
45,55±0,09e
4,59±0,02e
11,51±0,05e
54,53±0,08de
5,18±0,33d
120
39,14±0,07f
4,59±0,01f
12,31±0,08b
54,53±0,48ab
5,41±0,24c
Fuente: Romel et al. (2008)
2.3 Antocianinas
Las antocianinas derivan del griego anthos flor y kyanos azul, son el grupo más importante de pigmentos
solubles al agua visibles para el ojo humano, forman parte de la familia de los polifenoles y se definen como
flavonoides fenólicos (Cuevas et al., 2008). Los enlaces conjugados en sus estructuras, que absorben la luz
a aproximadamente 500 nm, son la base de los colores rojo, azul y morado de las frutas, verduras y sus
productos. La degradación es causada por oxidación, escisión de enlaces covalentes o reacciones de
oxidación mejoradas debido al procesamiento térmico (Patras et al., 2010).
2.4 Polifenoles
Manach et al. (2004) sostienen que, los polifenoles son micronutrientes abundantes en nuestra dieta y la
evidencia de su rol en la prevención de enfermedades degenerativas tales como cáncer y males
cardiovasculares son emergente. La principal función de los polifenoles se encuentra asociada a la defensa
de las plantas, frutas y flores, así como a la generación de los sabores y aromas de los frutos, equilibrio
hormonal, coloración, propiedades antitrombóticas, vasodilatadoras, inmunes supresores y
antimicrobianos (Ladaniya, 2008). Peláez et al. (2016), reportan valores de contenido de polifenoles totales
en almendras de cacao Forastero y CCN 51 en estado fresco y durante la fermentación donde a 0, 48, 72,
96, 120, 144 y 168 horas de fermentación tienen 7,05; 7,03; 6,93; 6,82; 6,41; 6,36 y 5,05 g EAG/100g de
muestra.
2.5 Ensayo de Folin-Ciocalteu
El método de Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes.
El reactivo contiene molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando
complejos de ácidos fosfowolfrámico o fosfotunsgénico (H3HW12O40) y ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40)
(Kramling & Singleton, 1969).
Chávez-Salazar, A. et al.
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2.6 Efecto de las operaciones poscosecha del cacao (Theobroma cacao L.)
Los cotiledones son blancos y en la parte interna es púrpura, dependiendo de la cantidad de antocianinas.
Durante la fermentación de las almendras de cacao, ocurre la muerte del embrión. Por tanto los compuestos
fenólicos entran en contacto con enzimas tales como polifenol oxidasa y glicosidasas presentes en las
semillas de cacao provocando reacciones de oxidación, la formación de complejos con las proteínas,
formación de compuestos denominados quinonas, que a su vez se someten a acoplamiento covalente con
los grupos reactivos de aminoácidos, péptidos, proteínas y fibras (Brito et al., 2000). Además, el contenido
total de polifenoles disminuye alrededor del 70%, y el contenido epicatequina se reduce aproximadamente
90%. Las antocianinas se hidrolizan rápidamente en antocianidinas y azúcares (galactosa y arabinosa) por
glicosidasas. Este proceso explica el blanqueamiento del color púrpura de los cotiledones (Fenglin et al.,
2013). Durante esta etapa, se inicia la formación de precursores de sabor y el desarrollo de color, y una
reducción significativa en el amargor (Biehl et al., 1990; Voigt et al., 1994).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Lugar de ejecución
La investigación se desarrolló en los laboratorios de Físico-química, Biotecnología e Investigación de la
Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM); y los
laboratorios de Investigación de la Facultad de Ingeniería Agroindustrial, de la Universidad Nacional de
San Martín.
3.2. Materia prima
Se utilizaron 240 kg de cacao en baba (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51, que se acopiaron en la
plantación de la empresa Romerp Trading, ubicada en el distrito de la Banda de Shilcayo, provincia de San
Martín, departamento de San Martín.
3.3. Métodos de análisis físico químico
Humedad: Método 934.06 (AOAC, 2005).
Cenizas: Método 940.26 (AOAC, 2005).
Fibra bruta: Método 930.10 (AOAC, 2005).
Proteína: Método microkjeldahl, 920.152 (AOAC, 2005).
Grasa: Método 930.09 (AOAC, 2005).
Acidez titulable: Método 942.15 (AOAC, 2005).
pH: Método potenciométrico 981.12 (AOAC, 2005).
Sólidos solubles: Con refractómetro, Método 931.12. (AOAC, 2005).
Determinación de la temperatura en la fermentación: Por el método reportado por Gutierrez (2007)
Determinación de la fermentación: Por método de prueba de corte según las NTP - ISO 1114 (2016).
Preparación de muestra para ensayo
Se realizó la mezcla de la muestra del lote final obtenida según el método especificado en la ISO 2292. Se
procedió con el método de cuarteo hasta la obtención de una cantidad superior a 300 granos, se hizo un
corte longitudinal por la parte central de cada uno granos, a fin de exponer la máxima superficie de corte
de los cotiledones. Se contaron separadamente los granos defectuosos, como mohosos, pizarrosos,
partidos, violetas, vanos, múltiples, germinados, dañados por insectos. Y los granos de buena fermentación
Chávez-Salazar, A. et al.
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presentan una coloración marrón o marrón rojiza y estrías de fermentación profunda y se calculó con la
siguiente fórmula:
Dónde:
%F = grado de fermentación en porcentaje; y Nƒ = número de granos fermentados.
Evaluación del color de los granos del cacao
El color de los granos se determinó mediante un colorímetro marca Cónica –Minolta CR -310 (Emmanuel
et al., 2012).
Preparación de la muestra para análisis de polifenoles totales y antocianinas en granos de cacao
Los granos de cacao fueron descascarillados de forma manual para la obtención de las almendras, luego
todas las muestras frescas o en proceso de fermentación fueron secadas mediante liofilización hasta
humedades de 7% y desgrasadas por el método de Folch (Aelson et al., 2009) y molidas utilizando un
mortero y pilón, para reducir el tamaño de partícula.
Preparación del extracto hidroalcohólico
Se pesaron 3g de muestra desengrasada, luego se enrasó a 30 ml de solución hidroalcohólica (50/50 v/v
agua: etanol) y se transfirió en frascos de color ámbar, se tapó herméticamente y se realizó una extracción
asistida mediante ultrasonido por 50 minutos a 50ºC, se filtró, se almacenó a -18°C, en frascos de color
ámbar.
Determinación de polifenoles totales
Se aplicó el método espectrofotométrico Folin Ciocalteu, reportado por Sandoval et al. (2001).
Determinación de la curva estándar
Se preparó una solución de ácido gálico a una concentración de 2mg/mL, a partir de ello se prepararon
diluciones con concentraciones de: 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 y 1mg/mL, cada dilución se preparó por
triplicado. Se agregó a cada tubo 1580µL de agua desionizada, 20µL de muestra control y ácido gálico, para
el control se adicionó 20mL de agua desionizada; se homogenizó, luego se agregó 100µL de solución de
fenol Folin Ciocalteu, se incubó por 1 minuto a temperatura ambiente; luego se agregó 300µL de Na2CO3 al
20% y finalmente se incubó por 2 horas a temperatura ambiente y en oscuridad, se realizó la lectura en
espectrofotómetro UV/VIS a 700nm; con los resultados se determinó el gráfico de la concentración
respecto a absorbancia.
Cuantificación de polifenoles totales
Considerando el extracto hidroalcohólico 100mg/mL (filtrado y centrifugado a 10000rpm/10min a 4ºC),
se realizó la dilución del extracto de acuerdo a la concentración encontrada, con 3 repeticiones por
tratamiento, se realizó el mismo procedimiento para la curva estándar. Las absorbancias fueron
reemplazadas en la ecuación de la curva estándar y expresadas en equivalente de ácido gálico (g EAG/100g
de muestra seca).
Chávez-Salazar, A. et al.
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Determinación de antocianinas
Se aplicó el método del pH diferencial.
Selección de longitud de onda de trabajo
La longitud de onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima (λmax). Las
mediciones se realizaron a las longitudes de onda de 520nm (máxima longitud de onda determinada) y a
700nm.
Preparación de las soluciones Buffer
Se prepara los Buffer pH = 1 (Cloruro de potasio 0,025 M) y Buffer pH = 4,5 (Acetato de sodio 0,4 M).
Se tomó una muestra del extracto hidroalcohólico y se diluyó apropiadamente (para conseguir una
absorbancia en el rango de 0,2 a 1,4 medidos a 520nm) utilizando las soluciones buffers indicadas; y luego
se mide la absorbancia, frente a un blanco a las longitudes de onda de 520 y 700nm.
Determinación del contenido de antocianinas totales
Con los valores de absorbancia registrados para cada dilución (pH 1 y 4,5) y en cada longitud de onda (520
y 700nm), se procede a determinar el contenido total de antocianinas del extracto, utilizando la siguiente
ecuación:
Las absorbancias obtenidas serán reemplazadas en la ecuación y expresada como mg cianidina -3-
glucósido por litro.
Dónde:
PMA = Pigmentos monoméricos de antocianinas (mg/l).
A = Absorbancia de la dilución de la muestra.
MW = Peso molecular de la cianidína-3-glucósido es 449,2.
DF = Factor de dilución.
ε: La absortividad molar a 520nm, a pH = 1,0.
pH = 4,5 es la corrección de la formación de productos de degradación es 26 900.
l = Longitud de paso de la celda 1cm.
1000 = Factor de conversión de g a mg. La ecuación permite cuantificar las antocianinas, y expresadas como
antocianinas monoméricas (Am) en mg/L.
Expresión de antocianina en función de gramos de base seca de la muestra
Para fines de discusión y análisis de concentración de antocianina en la muestra analizada, se hace
necesario la conversión de dicho resultado a base seca de la muestra analizada (mg/g); para cuyo efecto se
aplicó la siguiente expresión:
Chávez-Salazar, A. et al.
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Dónde:
ATmx = Concentración de antocianina total en base seca de la muestra (mg/g).
Am = Concentracion de antocianina en el extracto hidroalcohólico (mg/L).
Vin = Volumen del extracto hidroalcohólico (L).
Mx = Peso de la muestra en base de la muestra en base seca utilizada (g).
Mx= mh (1-(%H/100)).
Mh: Peso de la muestra húmeda utilizada para el análisis (g).
%H: porcentaje de humedad en la muestra analizada (%).
3.4. Análisis estadístico
Para evaluar los resultados se utilizó el modelo estadístico Diseño Completo al Azar (DCA) con cuatro
repeticiones, aplicando un ANOVA y para los que presentan diferencias significativas a (p>5) se aplicó la
prueba de LSD, empleando el siguiente modelo matemático. Para el análisis estadístico se utilizó el software
IBM SPSS Statistic 22.
Dónde:
= Resultados de la evaluación de polifenoles totales, antocianinas y el análisis fisicoquímico.
µ = Media general.
i = Al efecto i - ésimo factor altura de fermentación de cacao.
= Error experimental de modelo.
3.5. Metodología experimental
Para el beneficio del cacao, se siguió la metodología de la Figura 1.
Figura 1. Flujo de operaciones para beneficio del cacao (Theobroma cacao L.); cultivar CCN 51
En el Anexo 1, se muestra el diseño experimental para la evaluación de las características físico químicas,
por efecto de la fermentación y secado del cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51.
Chávez-Salazar, A. et al.
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Características del cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 en baba y fermentado
Composición proximal del cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 en baba
En la Tabla 2 se presenta la composición proximal en base seca de los granos de cacao en baba, extraídos
de las mazorcas de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51. Resultados similares fueron encontrados
por Romel et. al. (2008), quienes reportaron el contenido proximal en base seca de cacao fresco y
fermentado encontrando que la humedad fue 57,85%; aceites y grasas 54,45%; cenizas 5,73%; proteína
12,44% y fibra 2,65%.
Tabla 2.
Composición proximal del cacao en baba cultivar CCN 51
Muestra
Humedad
Aceites y
grasas
Cenizas
Fibra
Proteína
Base seca
140,5
52,9
6,5
4,1
13,2
Base húmeda
58,4
22
2,7
1,7
5,5
Evaluación del color de la almendra del cacao cultivar CCN 51 fermentados
Los resultados de los parámetros de color (L*; a* y b*), se muestran en la Tabla 3. Mostrando menor
oscurecimiento los granos fermentados a 0,2 metros respecto a otra altura, posiblemente se deban a la
menor ventilación y mayor temperatura de la masa de granos facilitando las reacciones de oxidación
enzimática. Al respecto, Chire et al. (2016) estudiaron la relación de los valores que integran el color de los
granos de cacao nativo mezcla de granos tinto y blancos durante el proceso de fermentación reportaron
valores promedio del color que comprendieron L* de 52,03 a 53,525; a* de 12,64 a 11,66 y b* de 12,59 a
3,87 en granos de cacao en el proceso de fermentación.
Además, se observa que el mayor valor de cromaticidad a* es en la muestra de cacao fermentado a 1 m de
altura con un valor de a* de 20,49, seguido de la muestra fermentada a 2 m con a* de 18,78 y el más bajo a
0,2 m con a* de 8,33. El mayor valor de b* es 13,96 de granos fermentados a 2 m del cajón fermentador.
Ortiz, et al. (2009) consideran que, el oscurecimiento de los granos durante el proceso fermentativo es
producido por la hidrólisis de las antocianinas y la posterior oxidación de las agliconas resultantes a
compuestos quinónicos, los cuales contribuyen al color pardo propio del cacao fermentado. Y este color
difiere entre los tipos de grano.
Tabla 3.
Resultados promedio de los parámetros de color de las almendras de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar
CCN 51, fermentado a diferentes alturas
Tipo de secado
L*
a*
b*
A 0,2 m de altura
15,18±0,21a
8,33±0,32a
7,96±0,26a
A 1 m de altura
10,80±0,02b
20,49±0,26b
12,80±0,05b
A 2 m de altura
11,83±0,19c
18,78±0,61c
13,96±0,12c
La combinación de los valores triestimulos L*, a* y b* dan un color marrón pardo oscuro debido a la
descomposición parcial de las antocianinas y a la oxidación parcial de los polifenoles influido especialmente
por la enzima polifenoloxidasa que imparten este color característico. Emmanuel et al. (2012) y Afoakwa
et al. (2011) observaron que, las muestras se volvieron más oscuras a medida que aumentaba la
fermentación y la luminosidad también disminuyó progresivamente con el aumento del almacenamiento.
Chávez-Salazar, A. et al.
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Contenido de polifenoles (g de Equivalente de Ácido Gálico/100g de m. s.) del cacao cultivar CCN 51
en baba y durante la fermentación
En la Tabla 4 se observa el contenido de polifenoles en muestras de granos de cacao posterior al proceso
de fermentación a diferentes alturas. Wollgast & Anklam (2000) encontraron en granos de cacao Forastero
no fermentados contenidos de polifenoles totales de 12-18g EAG/100g de m. s. Además, se observa que el
mayor contenido de polifenoles a las 156 horas de fermentación se encuentra en los granos de cacao
fermentados a 1 metro de altura del cajón fermentador con 12,58±0,22 g EAG/100g de m. s., a 0,2 metros
y 2 metros con contenidos de 12,35±0,36 g EAG/100g de m. s. y 12,36±0,36 g EAG/100g de m. s.,
respectivamente.
Al respecto, los polifenoles en estado natural se encuentran compactados en vacuolas de células específicas,
se difunden a través del cotiledón durante la fermentación del cacao (Brito et al., 2002) y se someten a
modificación bioquímica a través de la polimerización y la complejación con la proteína, dando como
resultado la disminución de la solubilidad y la astringencia de las almendras del cacao sin fermentar
(Bonvehi y Coll, 1997). Los polifenoles en el cacao se reducen durante la fermentación y por lo tanto la
capacidad antioxidante del cacao también (Aikpokpodion & Dongo, 2010). El polifenol oxidasa es la oxidasa
principal en los granos de cacao y es responsable de catalizar la oxidación de polifenoles durante los
procesos de fermentación y secado. Se dice que esta enzima se activa durante la fase aeróbica de la
fermentación como resultado del oxígeno que permea el cotiledón (Thompson et al., 2001).
Efraim et al. (2010) mencionan que, el contenido de compuestos fenólicos se redujo en 35% al tercer día y
59% en el séptimo día de la fermentación, valores mucho mayores a los obtenidos en esta investigación, y
es posible se deba a una serie de factores internos como los genotipos, grado de madurez del grano, edad
de la planta y externos como condiciones climáticas, tiempo de aguante, tipo de fermentadores, reacciones
enzimáticas y presencia del ácido acético.
Contenido promedio de antocianinas (mg cianidina-3-glucosido/g de m. s.) del cacao cultivar CCN
51 en baba y durante la fermentación
En la Tabla 4 se observa que el mayor contenido de antocianinas a las 156 horas de fermentación se
encuentra en los granos de cacao fermentados a 0,2 metros de altura del cajón fermentador con 3,36±0,11
de mg cianidina-3-glucosido/g de m. s., seguido de 1 metro con contenido de 1,92±0,31 mg cianidina-3-
glucosido/g de m. s. y 2 metros con contenido de 1,80±0,52 mg cianidina-3-glucosido/g de m. s. En la Tabla
4, se encontró en el cacao en baba 5,78±0,37 mg cianidina-3-glucosido/g de m. s., disminuyendo hasta en
un 68,77% para el cacao fermentado, a una altura del cajón fermentador de (2m.), siendo el que mayor
reducción experimentó. El menor porcentaje de degradación (42,38%) de las antocianinas fue cuando el
proceso de fermentación se realizó a una altura del cajón fermentador a (0,2m.), a 1 y 2m. de altura se
perdieron 66,54 y 68,77% de antocianinas, respectivamente.
Chávez-Salazar, A. et al.
10 Rev. Agrotec. Amaz. 3(2): e555; (jun-dic, 2023). e-ISSN: 2710-0510
Tabla 4.
Evolución de la temperatura, pH de la almendra, contenido de polifenoles totales (g EAG/100g de m. s.) y antocianinas (mg cianidina-3-glucosido/g de m. s.) del grano en
baba y durante la fermentación del cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51
Tiempo de
fermentación
A 0,2 metros de altura
A 1 metro de altura
A 2 metros de altura
Temperatura.
°C
pH
Cotiledón
Polifenoles
totales (g
EAG/100g de
m. s.)
antocianinas
(mg
cianidina-3-
glucosido/g
de m. s.)
Temperatura
°C
pH
Cotiledón
Polifenoles
totales (g
EAG/100g
de m. s.)
antocianinas
(mg
cianidina-3-
glucosido/g
de m. s.)
Temperatura
°C
pH
Cotiledón
Polifenoles
totales (g
EAG/100g de
m. s.)
antocianinas
(mg
cianidina-3-
glucosido/g
de m. s.)
0 hrs.
31,00±0,00
6,46±0,04
15,14±0,14a
5,78±0,37 a
31,00±0,00
6,46±0,04
15,14±0,14a
5,78±0,37 a
31,00±0,00
6,46±0,04
15,14±0,14a
5,78±0,37 a
48 hrs
(2dias)
34,00±0,82
6,20±0,59
13,97±0,26 b
4,92±0,26 b
34,00±0,82
6,18±0,58
13,40±0,25 b
4,41±0,29 b
34,00±0,82
6,26±0,59
14,15±0,35 b
4,96±0,31 a
96 hrs
(4 días)
52,30±0,50
4,68±0,17
13,34±0,26 b
4,36±0,35 b
52,30±0,96
4,53±0.32
12,79±0,25 c
3,18±0,23 c
51,30±0,78
5.76±0,19
13,29±0,38 c
3,90±0,20 c
156 hrs
(6 1/2 días)
45,00±0,82
4,40±0,18
12,35±0,36 c
3,36±0,11 c
44,00±0,82
4,45±0,13
12,58±0,22 c
1,92±0,31 b
40,00±1,63
4,46±0,18
12,36±0,36 d
1,80±0,52 d
Degradación (%)
18,39
42
13,35
66,73
18,4
68,77
Nota: Letras diferentes indican la existencia significativa a un (p<0,05) a un nivel de confianza del 95% para las diferentes alturas de ubicación de los cajones
fermentadores.
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El análisis de varianza determinó diferencias significativas entre los resultados de las medias de
antocianina en las 3 alturas de ubicación de los cajones fermentadores. La degradación posiblemente se
deba a la mayor rapidez de las reacciones de oxidación por presencia del aire ambiental circundante y el
calor producido al cuarto día el que fue superior a los 50°C al interior del cajón fermentador. Adams (1973)
informó que la antocianina se descompone al calentarse en una estructura de chalcona, siendo ésta última
transformada en un derivado de cumarina glucósido con pérdida del anillo, Seeram et al. (2001)
demostraron que, las altas temperaturas en combinación con un alto pH causan la degradación de las
antocianinas que dan como resultado tres derivados diferentes del ácido benzoico. Por otro lado, la
presencia de oxígeno acelera la degradación de las antocianinas ya sea a través de un mecanismo de
oxidación directa. En aplicaciones de control de calidad, la pérdida de antocianina ha sido considerada
como una buena fermentación de los granos de cacao, junto con la formación de un color marrón. Por lo
tanto la prueba de corte y las mediciones del índice de fermentación se basan en los cambios de color en
los cotiledones durante la fermentación (Shamsuddin & Dimick, 1986).
De acuerdo a los resultados, la mejor muestra obtenida en la fermentación fue la ubicada a 1 metro de altura
del cajón fermentador, por lo que fue seleccionada para continuar con la investigación.
Variación promedio de la temperatura, solidos solubles de la masa y pH del cotiledón antes y
durante la fermentación
En la Tabla 4 se observan los resultados de las variaciones del pH del cotiledón durante los seis días y doce
horas de fermentación. Se aprecia que la variación del cotiledón lo hacen de manera proporcional durante
la fermentación, posiblemente debido a la mayor exposición del flujo de aire en el área de fermentación, es
decir a mayor altura mayor pH. Al respecto, Sanagi et al. (1997) mencionan que, el pH del cacao disminuye
ligeramente después de 3 días de fermentación. Schwan & Wheals (2004b) indica que el pH del cacao no
fermentado apropiadamente oscila entre 5,7 y 6. Respecto al contenido de solidos solubles se puede
observar que a las 48 horas de fermentación en los cajones fermentadores ubicados a 0,2; 1 y a 2 metros,
varían de 19,5 hasta 16,4; 15 y 12 a partir del tercer día no se encuentran solidos solubles, a mayor altura
de ubicación del cajón fermentador mayor fermentación de los sólidos solubles en función a la altura. Biehl
et al. (1985), encontraron disminución de los niveles de glucosa y fructosa en las almendras de cacao
durante la fermentación.
A las 96 horas de la fermentación del cacao, se observó que la temperatura máxima del grano en los
fermentadores oscila entre 51°C y 52,3 °C. Esto con variaciones de la temperatura ambiente de 28 a 33ºC
entre los días y noches de fermentación durante el periodo de fermentación de esta investigación. Los
granos de cacao normalmente fermentan entre cinco y siete días y es rica en glucosa, fructosa y sacarosa
(10-15%). (Apriyanto, 2016), el procesamiento de granos de cacao requiere un pH entre 5,2 a 5,8 para
producir manteca de cacao de alta calidad. Jespersen et al. (2005) indican que, en las fases iniciales de la
fermentación el crecimiento de las levaduras es favorecido por el alto contenido de azúcar, bajo pH y
disponibilidad limitada de oxígeno en la pulpa. La fermentación reduce el nivel de amargor y astringencia
del grano de cacao atribuida a la pérdida de polifenoles durante la fermentación (Reineccius et al., 1972)
La Tabla 4 indica un incremento lento de temperatura en los dos primeros días de fermentación, luego se
da un crecimiento acelerado de la temperatura alcanzando su pico máximo al cuarto día con una
temperatura máxima de 52,3°C en los cajones a una altura de 0,2 y 1 metros y de 51,3°C en el cajón a una
altura de 2 metros, provocando la muerte del embrión de la semilla de cacao y el desarrollo de los
precursores sensoriales del grano de cacao. Al respecto CAOBISCO/ECA/FCC (2015), indica que durante el
proceso de fermentación se genera calor, el mismo que puede alcanzar temperaturas aproximadamente de
50°C dentro de la masa de granos. Asimismo, la fermentación del cacao es esencial para la obtención de
almendras de buena calidad (Silva et al., 2014).
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4.2. Efecto del secado de los granos de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51
Degradación de los polifenoles durante el secado de las almendras del cacao (Theobroma cacao L.)
cultivar CCN 51
La Tabla 5 muestra el efecto del método de secado en el contenido de polifenoles totales de las almendras
de cacao. Se aprecia que las muestras secadas con flujo de aire caliente son las que experimentaron menor
porcentaje de degradación de los polifenoles respecto a las muestras secadas en cámara de secado solar y
directo al sol. Durante el secado los ácidos orgánicos inducen una reacción enzimática en el interior de las
almendras, dando como resultado cambios bioquímicos que generan varios compuestos críticos para el
aroma, el sabor y la formación de color (Biehl et al., 1985). Considerando el secado en diferentes tipos de
secadores, Efraim et al. (2010) encontraron que, los granos de cacao fermentados durante 3 días,
mostraron pérdidas de polifenoles de 19,1% (Secado al horno) y 10,8% (secado al sol) y que granos de
cacao fermentado durante 7 días mostró pérdidas de polifenoles de 11,6% (secado en horno) y 2,8%
(secado al sol), resultados que difieren a los encontrados en esta investigación.
Abhay et al. (2016) mencionan que, existen beneficios potenciales de los polifenoles de cacao para la salud
del ser humano. La composición y la cantidad de polifenoles en los granos de cacao varían fuertemente con
el tipo de almendra, el origen y los métodos de procesamiento. Típicamente, los contenidos de polifenoles
de cacao son de aproximadamente 6 a 8% en peso de un cacao seco fermentado (Crozier et al., 2011). Hii
et al. (2012), evaluaron la degradación de polifenoles en muestras de cacao secadas a 60°C y 80°C,
determinaron que la retención de polifenoles es mayor a 60°C, mientras que, a temperatura inferior a 70 °
C, el mecanismo de degradación podría atribuirse principalmente a la acción enzimática.
Tabla 5.
Efecto del método de secado en el contenido de polifenoles (g EAG/100g de m. s.) totales en granos de cacao
(Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 seco
Método de
Secado
Polifenoles totales (g EAG/100g de m. s.)
Degradación
de polifenoles
(%)
0 hr.
48 hr.
60 hr.
96 hr.
108 hr.
120 hr.
Cámara de
secado solar
13,12±0,22d
9,63±0,47c
8,56±0,90bc
7,87±0,44b
7,49±0,11a
6,81±0,45a
48,1
Directo al
sol
13,12±0,22c
12,07±1,42bc
11,15±0,48bc
10,21±0,61ab
8,30±0,72a
36,7
Secador
flujo de aire
caliente
13,12±0,22a
10,04±0,30b
9,19±0,31c
29,9
Efecto del método de secado sobre las antocianinas en almendras de cacao (Theobroma cacao L.)
cultivar CCN 51 seco
La Tabla 6 muestra el contenido de antocianinas en los granos de cacao por efecto del tipo de secador
utilizado. El secado con aire caliente conservó más antocianina, reportando una menor degradación
(65,23%) en comparación con los otros dos métodos de secado. La magnitud y temporalidad del
calentamiento tienen fuerte influencia sobre la estabilidad de las antocianinas; al respecto, Rhim (2002)
concluyeron que el contenido de antocianinas de baya de saúco es muy sensible al tratamiento térmico,
después de 3 h de calentamiento, sólo el 50% de pigmentos de saúco se conservaron a 95ºC. El
comportamiento de destrucción de antocianinas con un aumento aritmético en la temperatura es del tipo
logarítmico. Esto sugiere que los factores termo lábil pueden acelerar la destrucción del pigmento
antociánico y apoya la hipótesis de que las enzimas endógenas en las frutas causan la destrucción del
pigmento en el procesamiento del jugo (Patras et al., 2010).
Chávez-Salazar, A. et al.
13 Rev. Agrotec. Amaz. 3(2): e555; (jun-dic, 2023). e-ISSN: 2710-0510
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se recomienda el secado en equipos con flujo de aire caliente,
debido a que con este método se conservan en mayor porcentaje los polifenoles totales y las antocianinas
en mejor medida que con el secado directo al sol y con cámara de cámara de secado solar.
Tabla 6.
Efecto del método de secado en contenido de las antocianinas (mg cianidina-3-glucósido/g) en almendras de
cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 seco
Método de
secado
Antocianinas (mg cianidina-3-glucósido/g)
Degradación de
antocianinas
(%)
0 hrs.
48 hrs.
60 hrs.
96 hrs.
108 hrs.
120hrs.
Cámara de
secado solar
1,99±0,05e
1,23±0,05d
1,07±0,09c
0,91±0,1bc
0,46±0,04 ab
0,40±0,03a
80,1
Directo al sol
1,99±0,05d
1,27±0,12c
0,97±0,04b
0,82±0,08b
0,48±0,06 a
75,8
Secador flujo
de aire
caliente
1,99±0,05c
1,36±0,08b
0,69±0,1a
65,32
4.3. Caracterización de las almendras de cacao cultivar CCN 51 secados con flujo de aire caliente
Caracterización física de almendras de cacao cultivar CCN 51 seco
En la Tabla 7 se muestran los resultados de la caracterización física de los granos de cacao secados con flujo
de aire caliente. Estos resultados se encuentran dentro de los estándares de calidad mencionadas por
Stevenson et al. (1993), quienes mencionan que, en un proceso de fermentación normal se debe encontrar
como máximo 2% de almendras pizarrosas, 35% de almendras parcial o totalmente violetas. La
fermentación es de vital importancia, Shamsuddin & Dimick (1986) mostraron que la muestra que tenía
alto grado de fermentación alcanzó el mayor puntaje en sabor. Peláez et al. (2016) encontraron que, 87,3
±1% de fermentación con remoción manual.
Tabla 7.
Caracterización física del grano de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 secados con flujo de aire
caliente
Evaluación
Grano de cacao seco (%)
Enmohecidos
0
Pizarrosos
2
Violáceos
8
Pasillas
0
Porcentaje de fermentación
90
Evaluación del color de almendras de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 seco con
diferentes métodos de secado
En la Tabla 8 se presentan los resultados de la evaluación de los parámetros del color de las almendras de
cacao secadas. Al respecto, Bonaparte et al. (1998) encontraron puntajes más altos de color en almendras
de cacao secados directo al sol y el más bajo en secador solar. Los granos de cacao secados directo al sol
mostraron el valor más bajo de “a” (menos rojo) y estuvieron entre los valores más altos de “b” (menos
azul), teniendo así el menor de los pigmentos morados deseables. Aplicando secado indirecto a los granos
de cacao tenía el valor más alto para “a*” y un valor de “b*” ligeramente inferior, aunque no
significativamente. Los pigmentos morados fueron más visibles y enmascararon cada vez más los
pigmentos pardos, ya que los valores de “b*” disminuyeron por debajo de 10 en el medidor de color.
Chávez-Salazar, A. et al.
14 Rev. Agrotec. Amaz. 3(2): e555; (jun-dic, 2023). e-ISSN: 2710-0510
Tabla 8.
Resultados promedios de los parámetros de color de los granos de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN
51 sometidos a diferentes métodos de secado
Tipo de secado
L*
a*
b*
Cámara de Secador solar
23,66±0,19
13,34±0,08
10,34±0,03
Directo al sol
9,52±0,01
17,10±0,05
12,33±0,04
Secador flujo con aire caliente
16,31±0,07
16,44±0,04
11,18±0,07
Composición físico química de almendras de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 secado con
flujo de aire caliente
En la Tabla 9 se muestran los resultados de los análisis fisicoquímicos de las almendras de cacao secadas
con flujo de aire caliente. En lo que concierne a proteína, Aremu et al. (1995) encontraron 15,2 – 19,8%,
Bertazzo et al. (2011) 12 y 15,7%; sobre grasas éstos últimos autores reportaron de 46,2 a 53,6% según la
procedencia de las almendras de cacao; respecto a la humedad, Silva et al. (2014) encontraron que, de las
almendras secas variaron en el rango 4,03 - 7,48 en tres lotes para dos formas de secado, por lo que para
todos los ensayos que consideraron los valores se situaron por debajo del límite del 8%, establecido por
las especificaciones de estandarización recomendada por Brasil (2008).
Respecto a la concentración de polifenoles totales en la Tabla 9 se observa 7,59 g EAG/100g de muestra
secada con flujo de aire caliente desengrasado y un contenido de 0,64 mg cianidina-3-glucosido/g de
antocianinas. Al respecto, Nazario et al. (2013) encontrando el mayor contenido de polifenoles totales en
clones de cacao forastero y trinitario con valores de 5,72±0,039 y 5,59±0,051 g EAG/100g
respectivamente, en segundo lugar, en contenido de polifenoles por el CCN 51 con 5,18±0,03 g EAG/100g.
En cuanto al contenido de antocianinas se encontró que el CCN 51 tenía 0,43±0,003 y el Criollo 0,42±0,004
mg cianidina-3-glucósido/g de muestra.
En la Tabla 9 se observa que el valor promedio del pH es de 5,22. Comparando este valor con los valores
encontrados por INIA y GTZ (2005) para cotiledones secos con pre secado para CCN 51 descendieron de
pH 6,29 hasta 5,40 y sin pre secado de 6,40 hasta 5,38. Por lo tanto se puede concluir que el pH (5,22) de
ésta investigación se encuentra dentro de los parámetros encontrados por INIA y GTZ (2005). En la Tabla
9, se muestra el valor promedio de acidez equivalente a 0,25 g. de ácido acético /100 gramos de almendra.
Al respecto, (Nogata et al., 2006) en su investigación evaluación de la calidad comercial del grano de cacao
usando dos tipos de fermentadores, encontraron 0,37 ± 0,06 y 0,35 ± 0,06 de acidez para con 96 y 48 horas
de fermentación, ambas secadas al sol. La disminución de los valores de acidez, “principalmente de los
ácidos volátiles y libres en los granos fermentados y secados al sol coincide con el mayor descenso del
contenido de humedad durante el secado” (Chire et al., 2016)
Tabla 9.
Composición fisicoquímica de las almendras de cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51 secado con flujo
de aire caliente
Características físico químicas
Base seca
Polifenoles totales (g EAG/100g de m. s.)
8,13
Antocianinas (mg cianidina-3-glucosido/g de m. s.)
0,64
Acidez titulable (g. de ác. acético /100g. m. s.)
0,32
pH
5,22
Humedad (%)
6,6
Lípidos (%)
51
Fibra cruda (%)
6
Cenizas (%)
3,5
Proteína (%)
13,2
Carbohidratos totales (%)
26,6
Chávez-Salazar, A. et al.
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CONCLUSIONES
La altura de los cajones fermentadores indicó que la menor degradación de polifenoles se dio a 1 m
(13,35%), sin embargo, la evaluación estadística reportó que no hay diferencias significativas a 0,2, 1 y 2
m. La menor degradación de antocianinas (18,4%) fue a 0,2 m de altura del cajón fermentador, existiendo
diferencia significativa entre las tres alturas estudiadas. Respecto al color, la evaluación estadística indicó
diferencias significativas en los tres niveles, obteniendo un mejor color en muestras fermentadas a 1 m de
altura.
La menor degradación de polifenoles se obtuvo en muestras secadas con flujo de aire caliente (29,9%) y
antocianinas (65,32%). Existió diferencias significativas para polifenoles en muestras secadas directo al sol
y en secador solar, para antocianinas no existió diferencia significativa con los tres métodos de secado. Los
parámetros del color obtenido fueron 16,31±0,07; 16,44±0,04; 11,18±0,07 para L*, a* y b*,
respectivamente en muestras deshidratados con flujo de aire caliente a 55°C.
Las almendras de cacao obtenidas reportaron: 8,13 (g EAG/100g de m. s.); 0,64 (mg cianidina-3-
glucosido/g de m. s.); 0,32(g. de ácido acético /100g de m. s.); 5,22%; 6,6%; 51%; 6%; 3,5%; 13,2% y 26,6%
de, polifenoles totales, antocianinas, acidez titulable, pH, humedad, lípidos, fibra cruda, cenizas, proteína y
carbohidratos totales (análisis proximal en b. s.), respectivamente.
FINANCIAMIENTO
Ninguno.
CONFLICTO DE INTERESES
No existe ningún tipo de conflicto de interés relacionado con la materia del trabajo.
CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES
Conceptualización: Chávez Salazar, A., Guevara Pérez, A. y Encina Zelada, C.
Curación de datos: Guevara Pérez, A., Encina Zelada, C. y Vidaurre-Rojas, P.
Análisis formal: Chávez Salazar, A., Guevara Pérez, A. y Encina Zelada, C.
Investigación: Chávez Salazar, A., Guevara Pérez, A., Encina Zelada, C., Vidaurre-Rojas, P. y Muñoz-
Delgado, V.
Metodología: Guevara Pérez, A. y Encina Zelada, C.
Administración del proyecto: Chávez Salazar, A. & Guevara Pérez, A.
Recursos: Chávez Salazar, A.; Guevara Pérez, A., Encina Zelada, C., Vidaurre-Rojas, P. y Muñoz-Delgado, V.
Supervisión: Chávez Salazar, A. y Encina Zelada, C.
Validación: A.; Encina Zelada, C., Vidaurre-Rojas, P. y Muñoz-Delgado, V.
Redacción - borrador original: Chávez Salazar, A. y Guevara Pérez, A.
Redacción - revisión y edición: Encina Zelada, C., Vidaurre-Rojas, P. y Muñoz-Delgado, V.
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ANEXO
Anexo 1.
Diseño Experimental para la evaluación de las características físico químicas, por efecto de la fermentación y secado del cacao (Theobroma cacao L.)
cultivar CCN 51
Operaciones
de proceso
Cosecha de las
mazorcas
Etapa post cosecha o beneficio del cacao (Theobroma cacao L.) cultivar CCN 51
Análisis Físico y Químico
Fermentación
No: a nivel del piso
N1: a un metro del piso
N2: a dos metros del nivel del piso
Secado
So: natural bajo sombra
S1: natural expuesto al sol
S2: secador con flujo de aire a 55°C
Caracterización
-
Variables de
control
Madurez de la
mazorca
- Color del grano
- Temperatura (°C), solidos solubles,
pH, Acidez total de la pulpa.
- Color del grano
- Humedad (%)
- pH del cotiledón
- Composición químico proximal.
Color; Humedad; Acidez; Polifenoles;
y Antocianinas
Variables de
decisión
- Cambio de color
- Sonido al golpe
con los dedos
- Polifenoles y antocianinas del grano
- % Humedad del grano (7 – 7.5%)
- Polifenoles y antocianinas del grano
S2
R1, R2, R3,
R4
No(0,2m)
R1, R2, R3,
R4
N2(2,0m)
R1, R2, R3, R4
N1(1,0m)
R1, R2, R3, R4
So
R1, R2, R3,
R4
R3, R4
S1
R1, R2, R3,
R4
R3, R4
