Recibido: 12/04/2021

Aceptado: 15/06/2021

Identificación molecular de la microbiota gastrointestinal del lechón lactante

Molecular identification of the gastrointestinal microbiota of the suckling pig

Fabian-Dominguez, Fredy^{1,2,3[0000-0003-3577-5896]}; Vásquez-Rojas, Lourdes^{1,2[0000-0002-0202-9451]}; Baylon-Cuba, Miluska^{1,2[0000-0003-1103-345X];} López-Flores, Alicia^{3[0000-0002-4679-6353]} y Mialhe, Eric^{2[0000-0002-5498-4362]}

¹Universidad Nacional de Tumbes, Tumbes, Perú

²Incabiotec, Tumbes, Perú

³Universidad Nacional de San Martín, Tarapoto, Perú

ffabian@unsm.edu.pe

Resumen. La resistencia de microorganismos patógenos a los antibióticos y la posibilidad de residuos de antibióticos en los productos de origen animal provocan una atención creciente, siendo necesario el uso de alternativas potenciales como bacterias benéficas con carácter probiótico para reemplazar los antibióticos en la dieta de los animales. La metodología fue el aislamiento de bacterias ácido lácticas del tracto gastro intestinal de un lechón lactante, seguidamente se realizó la purificación bacteriana en medio de cultivo MRS, extracción de ADN, y en base de las secuencias del 16S ADNr fue amplificado por PCR con iniciadores universales. En el análisis bioinformático por el algoritmo de BLAST del National Center for Biotechnology Information se identificaron molecularmente, Lactobacillus farcimenis, Weissella sp, en el estómago; Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, en el intestino delgado y en el intestino grueso, Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus plantarum. En conclusión, existe una diversidad de Lactobacillus en el tracto gastrointestal del porcino, siendo un gran potencial como alternativa a los antibióticos en la alimentación y la inmunomodulación del sistema inmune del animal.

Palabras clave: farmacología, microorganismos, probióticos, porcinos

Abstract. The resistance of pathogenic microorganisms to antibiotics and the possibility of antibiotic residues in animal products are attracting increasing attention. Being necessary the use of potential alternatives such as beneficial bacteria with a probiotic character to replace antibiotics in the diet of animals. The methodology was the isolation of lactic acid bacteria from the gastrointestinal tract of a suckling pig, followed by bacterial purification in MRS culture medium, DNA extraction, and based on the 16S rDNA sequences it was amplified by PCR with universal primers. In the bioinformatic analysis of the National Center for Biotechnology Information, Lactobacillus farcimenis, Weissella sp, in stomach; Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, in the small intestine and in the large intestine, Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum. In conclusion, there is a diversity of Lactobacillus in the gastrointestal tract of the pig, with great potential as an alternative to antibiotics in feeding and immunomodulation of the animal's immune system.

Keywords: microorganisms, pharmacology, probiotics, swine

1            Introducción

Los antibióticos son usados como promotores de crecimiento y prevención de enfermedades en producción animal (1), como aditivo en pienso para los animales, contribuyendo a una mejora de la eficiencia económica; sin embargo, el uso excesivo de antibiótico se ha convertido en un problema de salud, tanto para la producción como para el consumidor. En efecto, el uso continuo de antibiótico, es el responsable de los residuos en productos cárnicos y consecuentemente, el riesgo de aumentar la resistencia bacteriana de bacterias patógenas de los animales y de importancia en salud humana (2,3). Como alternativa al uso de antibióticos, los probióticos han mostrado ser una solución con múltiples ventajas tanto para la salud animal como para mejorar la productividad (4).

El microbiota intestinal cumple actividades biológicas que el hospedero carece como, metabolismo de nutrientes, el buen desarrollo de la fisiología del sistema digestivo y la estimulación del sistema inmunitario (5). En animales sanos, la composición del microbiota intestinal permanece en un estado relativamente estable. Los factores de estrés, tanto internos (alergias) o externos (alimentación, condición de cría, mal uso de antibióticos, enfermedades) pueden desencadenar cambios en el microbiota intestinal, conduciendo a un desequilibrio del sistema de defensa y aparición de microorganismos patógenos, causantes de desórdenes digestivos, baja producción y probabilidad de muerte (6).

La función de los probióticos es de mantener la micro población intestinal en un estado estable y prevenir la proliferación de microorganismos patogénicos (7). Además, pueden ser beneficios en términos de mejor absorción de nutrientes, estimulación del crecimiento, aumento de peso y mejora del factor de conversión (8). En diversas investigaciones se han reportado que estas bacterias pueden suprimir la diarrea (9), disminuir la intolerancia a lactosa (10), y complicaciones post operatorias (11), posee actividad antimicrobiana (12), acción anti cancerígena colon rectal (13,14), reduce síntomas irritables del intestino (15), y previene la inflamación y enfermedades del intestino (16).

Varios géneros de bacteria pueden ser usados como probióticos; Lactobacillus, Pediococcus, Bacteroides, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus y Escherichia coli (17). La naturaleza de las bacterias Gram positivas tiene propiedades competitivas frente a bacterias patógenas en general de tipo Gram negativas (18). Las bacterias probióticas que han sido estudiada en su mayoría Bacillus (Lactobacillus y Bacillus subtilis) muestra gran potencia (19).

Lactobacillus es un componente esencial de la microbiota gastrointestinal de porcinos (20,21), el más representativo es Lactobacillus amylovorus abundante en lechones lactantes (22,23). Muchos microorganismos a menudo están implicados en diarrea post destete como E.coli enterotoxigenica (24)(25). En la suplementación alimenticia con Lactobacillus ha demostrado beneficio de la salud intestinal del lechón lactante destetado (26,27).

El éxito de los probióticos se debe a las siguientes funciones (28). Ser un habitante normal de la microflora intestinal. Moderado o fuerte habilidad de adherencia y mejora de la inmunidad de la mucosa intestinal. Resistencia a un número de antibióticos, coccidiostatos, sales biliares y tolerancia para un shock ácido de pH 2.0-2.5. Un espectro de inhibición o la prevención de agentes patógenos en el tracto gastrointestinal. Las investigaciones han mostrado que Lactobacillus es una especie ideal. Esto puede actuar como un probiótico en mejorar la producción, controlando los microorganismos patogénicos y reduciendo la diarrea en porcinos, especialmente para recién destetado (29).

La búsqueda de una mejor comprensión de cómo operan los probióticos ha catalizado un enorme interés en los procesos de biotecnología molecular que subyacen a las interacciones huésped-microbio. La percepción de los mecanismos de acción de probióticos no sólo puede ayudar a mejorar la credibilidad del concepto de probióticos, sino también para fomentar el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención o tratamiento de enfermedades gastrointestinales y autoinmunes (30). El objetivo del estudio fue caracterizar molecularmente el microbiota del tracto gastrointestinal del lechón destetado.

2            Materiales y Métodos

2.1        Material biológico

Se realizó una selección al azar de un lechón lactante, de una camada de 12 lechones de dos semanas de edad, condición normal de salud de la granja porcina en Tumbes.

2.2        Aislamiento bacteriano del tracto gastrointestinal

Las muestras de estómago, intestino delgado e intestino grueso del lechón lactante fueron colectados en medio de cultivo MRS, pH: 5.5 e incubado a 37 °C por 48 horas, para el aislamiento se realizó la dilución 1/40, posteriormente 100 ul de la dilución fue dispensado dentro del medio cultivo sólido MRS e incubado a 37 ºC por 24 horas. Las colonias bacterianas fueron contadas y subcultivadas. La bacteria purificada, diferenciada por tinción Gram, y almacenada a -20°C con una solución de glicerol al 15% del volumen final bacteriano.

2.3        Extracción de ADN genómico bacteriano

Se procedió a tomar 1.2 ml de medio de cultivo liquido MRS en un tubo de 1.5 ml y microcentrífugado a 10000 rpm por 2 min. Posteriormente se eliminó el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 500 ul de la solución PBS 1X estéril. Se lleva a centrifugar a 10000 rpm por 2 min, se elimina el sobrenadante añadiendo luego 200 ul de la solución TE (Tris 1M/0.1M EDTA). Luego llevar a ebullición por 10 minutos e inmediatamente colocar sobre hielo por 5 min centrifugar a 10000 rpm por 1 min. Transferir el sobrenadante a otro microtubo y se le agrega 1 ul de ARNasa y llevar a 65 °C por 15 minutos y almacenar.

2.4        PCR amplificación del gen 16S ADNr

La amplificación del gen 16S ADNr fue realizada mediante la técnica de PCR convencional. Para cada reacción se tomó 2.5 ul de buffer 10X, 1 ul de cloruro de magnesio 50 Mm, 0.1 unidad de taq polimerasa (invitrogen), 0.5 ul de Dntps a 10 mM, 0.6 ul de cada primer a 15 pmol, el juego de primer 16S ADNr foward F518: (CCAGCAGCCGCGGTAATACG), revers R800: (TACCAGGGTATCTAATCC), 17.6 ul de agua libre de nucleasas y 2 ul de ADN extraído en una reacción final de 25 ul. La programación para el termociclador, temperatura 94 °C por 6 minutos, 94 °C por 30 segundos, 58 °C por 45 segundos, 72 °C por 1 minuto,72 °C por 4 minutos y 4 °C por 10 horas, por 33 ciclos. Los datos de secuencias serán comparados con la secuencia bases de Gen Bank (National Center for Biotechnology Information) usando el algoritmo BLAST.

3            Resultados y discusiones

3.1        Bacteria ácido lácticas aisladas en el tracto gastrointestinal del lechón lactante

Las bacterias aisladas del estómago e intestino delgado crecieron a las 48 horas, intestino grueso a las 24 horas a temperatura de 37°C en incubación, se aisló 2 bacterias de estómago, 2 intestino delgado, 2 intestino grueso.

3.2        Caracterización molecular de bacterias ácido lácticas

La identidad de todas las cepas bacterianas fue analizado e identificado en la   secuencia de 16S ADNr fue identificado como, Lactobacillus farcimenis, Weissella sp, aislados del estómago; Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus aislado del intestino delgado y Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, aislado del intestino grueso. La secuencia ADN de identidad 16S ADNr fue 98 a 100% (ver Tabla 1)

Tabla 1. Porcentaje de homología de las bacterias identificadas molecularmente Tracto gastrointestinal Bacteria Porcentaje de homología Estómago Lactobacillus farceminis 98% Weissella sp 99% Intestino delgado Pediococcus pentosaceus 99% Lactobacillus brevis 100% Intestino grueso Pediococcus pentosaceus 99% Lactobacillus plantarum 100%

 

Existen abundantes microorganismos en el tracto gastrointestinal del porcino. Los Lactobacillus están presentes en el intestino como uno de los microorganismos predominantes (31). Nuestro resultado concuerda con (6), en donde el número de crecimiento de colonias bacterianas sobre agar MRS incremento de posterior a anterior en el intestino.  Indicando que el medio ambiente posterior del intestino es mejor para el crecimiento de bacterias tipo Lactobacillus que el medio ambiente anterior, debido al bajo pH en el estómago, sales biliares en el intestino y oxígeno en las heces. Estos resultados concuerdan con (32), pero el número de colonias es variable debido al tipo de crianza de porcinos, dieta y medio ambiente.

Los Lactobacillus en el tracto gastrointestinal del porcino cumplen un rol importante en mantenimiento del balance de microbios en el intestino, pero identificando los Lactobacillus dominantes ha causado mucho debate. Esto ha sido reportado que Lactobacillus fermentum (32), Lactobacillus acidophilus (33) y Lactobacillus ruminis (6) son los Lactobacillus dominante en el intestino de porcinos. Los resultados de este estudio mostro que Weisella sp tuvo mayor dominancia en estómago, Pediococcus pentosaceus en intestino delgado e intestino grueso, Lactobacillus plantarum en intestino grueso y heces, mientras otras especies fueron encontradas en cada órgano.

Por lo tanto, el dominio Lactobacillus en el tracto gastrointestinal y heces del porcino fue variable en este estudio en donde la edad, dieta, tipo de crianza influye en la población microbiana (34), ya que la muestra fue aislada de un lechón destetado. Lactobacillus ruminis ha sido encontrado por ser una especie dominante en intestino humano (35,36). Los resultados de este estudio indico que Lactobacillus ruminis no existe únicamente en el intestino delgado, por tanto, en el futuro, la característica de predominante de varios Lactobacillus en el tracto gastrointestinal con carácter probiótico puede ser útil en granja de porcinos.

 

4            Conclusiones

Existe una diversidad de Lactobacillus en el tracto gastrointestinal del porcino, estos microorganismos con carácter probióticos pueden ser usado como alternativa para reemplazar los antibióticos en la dieta y estimular el sistema inmunitario en los animales.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la empresa Incabiotec y al Canon y Sobrecanon de la Universidad Nacional de Tumbes por el financiamiento del trabajo de investigación.

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Conflicto de intereses

Los autores declaramos que no existen conflictos de interés.

Contribuciones de los autores

Fabian-Dominguez, Fredy; Vásquez-Rojas, Lourdes; Baylon-Cuba Miluska y López-Flores, Alicia: desarrollaron la parte experimental con animales, procesamiento de datos y redacción del manuscrito.

Mialhe Eric: diseño del estudio de investigación.