Recibido: 15/11/2020
Revisado: 15/12/2020
Publicado: 31/01/2021
Micropropagación de Phragmipedium kovachii, con fines de conservación genética
Micropropagation of Phragmipedium
kovachii, for genetic conservation purposes
1Universidad Nacional San Martin, Tarapoto, Perú
Resumen. Se estableció un protocolo de micro propagación de Phragmipedium
kovachii, con fines de conservación, se evaluó la
germinación y el efecto de auxinas y citoquininas durante las fases de
multiplicación de protocormos y enraizamiento de
plántulas de Phragmipedium kovachii. La investigación se realizó en el Laboratorio
de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Facultad de Ciencias Agrarias en la
Universidad Nacional de San Martín. La semilla de Phragmipedium
kovachii, procedió de la zona del Alto Mayo, se
evaluó el porcentaje de germinación según (Gálvez, 2005), con pH modificado a
7. Para la multiplicación y
enraizamiento, se utilizó un diseño completamente al azar (DCA), con diferentes
concentraciones de auxinas y citoquininas con 4 tratamientos, 5 repeticiones y
5 protocormos (fase de multiplicación), y 4
tratamientos con 5 repeticiones y 10 plántulas (fase de enraizamiento). Los
resultados mostraron una germinación de 60,48% y en la fase de multiplicación,
en los primeros días, los protocormos mostraron un
color Verde (V) en todos los tratamientos, pero fue cambiando con el tiempo, al
color marrón (fenolizada) (F). Según la Prueba de
Tukey (P<0,01), en los indicadores número de hojas por protocormo,
tasa de crecimiento y longitud de protocormo, el T3
fue el más significativo. En la fase de enraizamiento, la prueba de Tukey
(P<0,01), para altura de plántulas (cm), número de raíces/plántula y
longitud de raíces/plántula, se observó
que los tratamientos estadísticamente no difieren entre sí. Concluyendo que, el
protocolo utilizado es apropiado para propagar plántulas de Phragmipedium
kovachii en condiciones in vitro.
Palabras clave: auxinas,
citoquininas, micropropagación, orquídea,
phragmipedium
Abstract. We stablished a micropropagation
protocol of Phragmipedium kovachii, for preservation, germination
and the effect of auxins and cytokinins were
evaluated during the multiplication phases of protoorms
and rooting of seedlings of Phragmipedium kovachii. The research was conducted in the Plant
Tissue Cultivation Laboratory (LCTV) of the Faculty of Agricultural Sciences at
the National University of San Martín - Tarapoto. The
seed of Phragmipedium kovachii,
was from the Alto Mayo area, the percentage of seed germination was evaluated
(Galvez, 2005), with pH modified to 7. For multiplication and rooting tests, a
Design was used Completely Random (DCA), with different concentrations of
auxins and cytokinins with 4 treatments, 5 repetitions
and 5 protoorms (multiplication phase), and 4
treatments with 5 repetitions and 10
seedlings (phase rooting). The results showed a germination percentage of
60,48%, in addition; in the multiplication phase, in the first days the color
in the protoorms was green (V) in all the treatments,
but it was changing according to the time, until the brown coloration (phenolized) (F) became dominant. According to the Tukey
Test (P <0,01), in the indicators number of leaves per proto-form, growth
rate and length of proto-form, T3 was the most significant. In the rooting
phase, the Tukey test (P <0,01), in the indicators seedling height (cm),
number of roots/seedling and length of roots/seedling, it was obtained that the
treatments do not differ from each other statistically. Concluding that, the
protocol used is appropriate to propagate seedlings of Phragmipedium
kovachii under in vitro conditions.
Keywords: auxins, cytokinins, micropropagation,
orchis, phragmipedium
1
Introducción
La familia Orchidaceae cuenta con una gran diversidad genética, a nivel
mundial se conocen cerca de 30 000 especies, de las cuales en el Perú hay
aproximadamente 3 000. Esta riqueza de especies contrasta con su alta
vulnerabilidad a la presión antrópica por efectos de la extracción selectiva y
los cambios en el hábitat asociado a las poblaciones naturales. Las orquídeas son
uno de los grupos de plantas más apreciados en el comercio internacional de
especies ornamentales y debido a su diversidad, colores, formas y rareza, hay
muchas personas interesadas en su investigación, cultivo y colección (MINAM,
2017).
Estas
especies son vulnerables a los cambios ambientales, debido a su alto grado de
asociación a microambientes específicos (Krömer et
al., 2007, citado por Benavente et al., 2020). La explotación de especies
para su comercialización, ha ocasionado una fuerte
presión de extracción, debido a la demanda del comercio nacional e
internacional, poniendo en peligro a muchas especies. Como resultado, todas las
orquídeas están incluidas en la lista CITES (Convención sobre el Comercio
Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestre), donde se
registra a las especies cuyo comercio debe ser regulado para prevenir su
extinción (MINAM, 2015).
Las orquídeas forman semillas diminutas parecidas al polvo
que son fácilmente dispersadas por el viento por lo que no pueden almacenar
nutrientes en el embrión y a menudo dependen de los hongos (predominantemente Rhizoctonia spp.) para la
germinación de las semillas (Arditti & Ghani
2000, Brundrett et al., 2003 y Rasmussen 1995, citados
en Ritmejeryté et al., 2018). El hecho de que las
semillas sean de tamaño pequeño y de endosperma
reducido, dificulta el proceso de germinación (Pereira et al., 2005, citado por
Gonçalves et al., 2016).
Sin embargo, la germinación simbiótica no es necesaria si las
semillas son traspasadas a un medio estéril provisto de nutrientes y una fuente
de carbono (Gonçalves et al. 2016). Salgado et al., (2019) indica que, Knudson reporto en el año de 1922 que las semillas de
orquídeas son capaces de germinar asimbióticamente,
in vitro, incrementando enormemente las posibilidades de aumentar la población.
La técnica in vitro de germinación asimbiótica de
semillas puede servir para satisfacer la demanda de la industria de la
floricultura, así como para fines de conservación.
El cultivo de tejidos vegetales
permite la conservación de material vegetal en condiciones in vitro como una
alternativa útil de conservación ex situ (Tapia y Figueroa et al., 2017). Sin
embargo, se debe
tener en cuenta que, el conjunto de factores (medio de cultivo, estado de
madurez, calidad de semillas, relacionada directamente con la viabilidad)
pueden tener una incidencia particular para cada especie (Pérez-Martínez y
Castañeda-Garzón, 2016). Un medio
de cultivo puede ser definido como “una formulación de sales inorgánicas y
compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los
cultivos in vitro” (Roca y Mroginski, 1993, citado
por Mendoza, I. 2017).
La orquídea Phragmipedium kovachii. es una
especie endémica del Perú únicamente con poblaciones registradas dentro del
Bosque de Protección Alto Mayo. Es una especie declarada en peligro de
extinción encontrándose registrada en el apéndice I y en la categorización nacional
en el CR (Peligro Crítico) según el D.S. N°
043-2006-AG. Esta Orquídea se caracteriza por tener flores que alcanzan de 11 a
15 cm de ancho y porque en el labelo presenta una coloración blanca en su
interior, lo que lo diferencia de otras especies afines (MINAM, 2017).
La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo
de Tejidos Vegetales (LCTV) de la Universidad Nacional de San Martín - Tarapoto
(UNSM-T), el cual, por 26 años, viene desarrollando y optimizando protocolos
para propagar de manera in vitro, diferentes especies de orquídeas y
otras especies vegetales.
Dado que en
la actualidad existe poca o ninguna información sobre la micropropagación de Phragmipedium kovachii,
a pesar de ser una especie como todas las orquídeas difíciles de propagar y
de estar en peligro de extinción como se mencionan en los párrafos anteriores, se decidió realizar investigación en la micropropagación
de la orquídea Phragmipedium kovachii,
con fines de su conservación genética.
Se tuvo como objetivo general determinar un protocolo
de micropropagación de la orquídea Phragmipedium kovachii,
con fines de conservación genética, para lo cual se consideraron dos objetivos
específicos el de determinar un protocolo para el establecimiento de semilla in
vitro de Phragmipedium
kovachii, y el de evaluar el efecto de diferentes
concentraciones de Auxina y Citoquinina en las fases de multiplicación de protocormos y enraizamiento de plántulas Phragmipedium kovachii.
Finalmente se logró determinar que el protocolo
evaluado en las diferentes fases de la micropropagación de Phragmipedium
kovachii, sí es el apropiado para el cultivo in
vitro esta especie. De esta manera se está aportando a su conservación genética
y a la investigación científica de esta especie en peligro de extinción.
2
Materiales y métodos
2.1
Diseño
Se establecieron dos experimentos: fase de multiplicación de protocormos y fase de enraizamiento de plántulas de Phragmipedium kovachii.
Para cada uno se estableció un Diseño Completamente al Azar (DCA), utilizando 3
tratamientos y un testigo (evaluando concentraciones de citoquininas y auxinas)
con 5 repeticiones por tratamiento para la fase de multiplicación (Tabla 1), y 10
repeticiones por tratamiento para la fase de enraizamiento de plántulas (Tabla
2). Los datos obtenidos fueron procesados y analizados mediante un análisis de
varianza (ANOVA), y una comparación de medias mediante la prueba de Tukey a un
nivel de significancia de 1%.
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Tabla 1
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Tabla 2
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2.2
Ámbito
y periodo de estudio
El presente proyecto de investigación
se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV) de la
Facultad de Ciencias Agrarias (FCA) en la Universidad Nacional de San Martín –
Tarapoto (UNSM – T), ubicado en el distrito de Morales, provincia de San
Martín, región de San Martín, a una Latitud sur: 6°36’15”; Longitud oeste: 76°10’30”
y Altitud de 283 m.s.n.m., durante los meses de mayo a diciembre del año 2017.
2.3
Procedimiento
Obtención de la Semilla de Phragmipedium kovachii.
La semilla de Phragmipedium kovachii,
(Figura 1), se obtuvo del Instituto de Investigación Biológica de las
Cordilleras Orientales (INIBICO), quien cuenta con la autorización del Servicio
Nacional Forestal y de Fauna Silvestre (SERFOR) para cultivar y manejar esta
especie considerada en peligro de extinción.
Figura
1:
Semillas de la orquídea Phragmipedium kovachii. A) Vista en conjunto de las semillas. Aumento
10X. B) Vista individual de la semilla. Aumento 40X.
Desinfección de las semillas. Se realizó mediante el método de la jeringa con una
solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (NaOCl), el
procedimiento se desarrolló en una cámara de flujo laminar en el área de
siembras y transferencias del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la
FCA/UNSM-T. Los materiales utilizados fueron los siguiente: jeringas de 20 ml,
algodón, pinzas, bisturí, mango de bisturí, mechero, cámara de flujo laminar,
solución de hipoclorito de sodio (0,5%), semillas de Phragmipedium
kovachii., alcohol, frascos de vidrio, los que se
muestran en la (Figura 2A) (Gálvez, 2005). La desinfección se llevó a cabo de
la siguiente manera:
·
Se colocó
algodón en su interior y presionar bien, hasta que el algodón quedó
completamente compacto. Se colocaron las semillas, dentro de la jeringa, sobre
el algodón compactado (Figura 2B).
·
Se preparó
una solución de hipoclorito de sodio al 0,5%.
·
Se sumergió
la jeringa con las semillas en la solución de hipoclorito de sodio al 0,5%,
(Figura 2C), por 15 minutos, luego se absorbió la solución con la jeringa con
las semillas dentro, agitando por unos minutos y se expulsó la solución y se
enjuagó con agua destilada estéril, se repitió por tres veces y por un tiempo
total aproximado de 15 minutos (Figura 2D).
·
Se expulsó
toda la parte liquida y se extrajeron las semillas, para su posterior siembra.
Figura
2:
Desinfección de semillas de Phragmipedium kovachii; (A) materiales utilizados (jeringa, algodón,
pinza, semillas); (B) jeringa con algodón compactado y con las semillas dentro;
(C) jeringa con la solución desinfectante; (D) desinfección y enjuague de
semillas.
Establecimiento in vitro de semillas de Phragmipedium kovachii.
Con la
ayuda de un bisturí y mechero (Figura 3A), se cortó la base de la jeringa que contenía
a las semillas desinfectadas (Figura 3B), para extraerlas con una pinza y
colocarlas en una placa Petri estéril (Figura 3C). Se sembró las semillas con
una espátula, colocándolas en tubos de ensayo que contenían medios de cultivo
(Figura 3D), se taparon los tubos con su respectiva tapa y se los sello con
cinta para evitar la contaminación (Figura 3E). El medio de cultivo que se
utilizo fue el medio M&S modificado utilizado por Gálvez (2005), con pH
modificado a 7. Finalmente se rotularon los tubos, y se llevaron al área de
incubación a una temperatura, humedad relativa y Luz controlados. Se cubrieron
los tubos con papel aluminio con la finalidad de brindarles oscuridad (Figura
3F), que es un requerimiento de Phragmipedium
kovachii, según Gálvez (2005), para que las
semillas puedan germinar.
Figura 3: Siembra in vitro de semillas de Phragmipedium
kovachii, (A) cortando la base de la jeringa; (B)
jeringa cortada; (C) extracción de semillas; (D) siembra de las semillas en
tubo de ensayo; (E) tapado y sellado de tubos; (F) tubos de ensayo con semillas
sembradas.
2.4
Sistema de variables
Porcentaje
de viabilidad óptica de la semilla. Se tomaron 10 grupos de semilla, que fueron observados con la
ayuda del estereoscopio, en cada observación se tuvo en cuenta el número de
semillas con embrión y el número de semillas sin embrión, (las semillas con
embrión fueron contadas como viables y las semillas sin embrión, como no
viables), luego se calculó el porcentaje en base al total de semillas de cada
muestra.
Porcentaje de germinación de la semilla. Se observó la germinación, tomando un total de 10
muestras al azar (aproximadamente 20 semillas por muestra), y se obtuvo el
promedio de germinación total (Figura 4).
Figura 4: Germinación de la semilla de Phragmipedium kovachii. (A) semillas abultadas y con ruptura de
testa; (B) semillas sin testa (color blanco) y protocormos
(color verde)
Efecto de
auxina (ANA) y citoquinina (BAP) durante las etapas de la micro
propagación de Phragmipedium kovachii. Se realizaron evaluaciones en dos
fases de la propagación de orquídeas, en la fase multiplicación de protorcomos, en donde observo la coloración de protocormos, número de hojas y altura o longitud de protocormos y en la fase de enraizamiento de plántulas, en
donde se evaluó el número de hojas, altura de plántulas, número de raíces y
longitud de raíces.
Fase de
multiplicación de protocormos de Phragmipedium
kovachii. Consistió en evaluar primeramente
la coloración de protocormos, mediante dos criterios
de evaluación: Verde (protocormo de color verde) y Fenolizado (protocormo color
marrón), además, se evaluó el número de hojas por protocormo,
contando el número de hojas por unidad experimental, y la longitud de protocormos, midiendo con una regla centimetrada desde la
base del protocormo hasta el ápice de la última hoja,
todas estas evaluaciones fueron realizadas cada quince días durante seis fechas
de evaluación.
Fase de
enraizamiento de plántulas de Phragmipedium
kovachii. Se evaluó el número de hojas por plántula,
mediante la contabilización del número de hojas por plántula, además se evaluó
la altura de plántulas, con una regla centimetrada, el número de raíces por
plántula, se contó individualmente por plántula y la longitud de raíces, se
midió con una regla y una linterna para observar a trasluz, para obtener una
mejor validez de los datos, ya que el color oscuro del medio de cultivo
dificultaba la observación, todas las evaluaciones se realizaron cada quince
días durante seis fechas, obteniéndose un promedio por cada tratamiento
evaluado.
2.5
Análisis estadístico
Todos los
datos fueron tabulados en hojas de cálculo Excel, siendo procesados y
analizados mediante un análisis de varianza (ANVA), y un test
de comparación de medias (Tukey, P<0,05). Para realizar este análisis se
utilizó el paquete estadístico InfoStat (version 2012e; Córdoba, Argentina).
3
Resultados y discusiones
3.1
Porcentaje de viabilidad óptica de semillas de Phragmipedium kovachii.
En la Tabla 3 se puede observar que el porcentaje de
viabilidad de la semilla supera al 60% en promedio en todas las muestras
observadas.
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Tabla 3
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Según los resultados, se obtuvo un porcentaje promedio
de 61,47 de viabilidad, lo que supero a los resultados obtenidos por Gálvez
(2005), quien obtuvo 35,6% en sus evaluaciones, esta diferencia se asume
que se debe a factores que tienen que ver con el material genético vegetal
(semillas), como el tiempo de maduración de la semilla, tiempo a la cosecha,
tiempo de almacenamiento, etc. Con respecto a esta especie todavía no hay más
información. Mientras que Duarte et al. (2017) encontró que en la
orquídea Phaius tankervilleae varía
entre 17,45 y 33,30% respectivamente e indica que la diferencia se debe al
tamaño de los frutos o capsulas de la orquídea.
3.2
Porcentaje de germinación de semilla de Phragmipedium kovachii.
La Tabla 4
muestra el porcentaje de germinación de semillas, quien fue mayor al 50% en
todas las muestras observadas.
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Tabla 4
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*% de
germinación: es el promedio general de las cuatro pruebas que se realizaron
Según los resultados obtenidos en donde se evaluó el
porcentaje de germinación de semillas de Phragmipedium
kovachii, se observó un porcentaje promedio de
germinación de 60,48%, superando al resultado obtenido por Gálvez (2005), que
fue de 25,4% de germinación, lo que indica que el protocolo y el medio de
cultivo utilizado son eficientes. Se asume que la diferencia existente se debe
a la variación en el pH modificado, mientras que Gálvez (2005) utilizo un pH de
5,1 a 5,4, en el presente trabajo de investigación se utilizó un pH de 7,0. Lo
que es corroborado por Thompson, (1980), quien indica que el nivel de pH es
también importante ya que la mayoría de orquídeas
germinan en un medio de pH 5,5. Sin embargo, existen especies andinas prefieren
niveles más altos de pH, 5,6 al 5,9.
Sin embargo, Banda-Sánchez
et al. (2017) muestran que en Prosthechea
obtuvo 29 % de semillas germinadas y afirma que la diferencia puede deberse
a la maduración del fruto. Quien está de acuerdo con Pérez-Martínez et al.,
(2016) que afirman que la germinación de semillas de orquídeas cultivadas in
vitro a partir de cápsulas, varía dependiendo de su
madurez, de la calidad de las semillas y del tipo de orquídea.
Asimismo, Kunakhonnuruk et
al. (2018) aseguran que el éxito de germinación de la semilla in vitro
depende del grado de madurez de la semilla y además dicen que también depende
del tipo de polinización del fruto. Esto hace ver que sí es posible la
propagación in vitro de orquídeas entre ellas Phragmipedium
kovachii. a partir semillas lo que concuerda con
MINAM (2013) quien menciona que es posible obtener un gran número de plantas a
partir de la germinación de semilla mediante el cultivo in vitro. También se
puede ver que para tener éxito en la germinación asimbiótica
de orquídeas dependerá de muchos factores tanto extrínsecos e intrínsecos de cada
especie de orquídea, por lo que es muy necesario realizar trabajos de investigación
en cada una de las especies.
3.2. Fase de
multiplicación de protocormos de Phragmipedium
kovachii.
Coloración
de protocormos. Se evaluó los cambios de
coloración durante seis (Tabla 5).
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Tabla 5
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*(D): Dominancia: V
(Verde); F (Fenolizado).
Se observó que en los primeros días de evaluación la dominancia
del color de protocormos es Verde (V) en todos los
tratamientos; pero esto va cambiando según van pasando los días hasta llegar a
ser dominante la coloración marrón (Fenolizada) (F). En
cuanto a los protocormos, Vargas (2012), menciona que
los protocormos de las orquídeas epífitas son
comúnmente verdes, lo que les posibilita producir parte de su alimento.
Sin embargo, Gálvez (2005), en su trabajo de investigación
indica que después de 2 semanas de la siembra observó que sufrieron problema de
fenolización o muerte (color marrón), menciona que
esto se debe al tiempo transcurrido de repique, ya que es necesario el
reemplazo del medio de cultivo cada cierto tiempo (30 días), Rodríguez (1999),
citado por Gálvez (2005) indica que, es necesario realizar repique cada 30
días, para evitar fenolizaciones, porque algunas
especies contienen sustancias endógenas que exudan la superficie, lo que se
puede evitar utilizando antioxidantes, además si la humedad relativa es muy
baja, durante el periodo de cultivo se puede presentar deshidratación del medio
y aumentar la salinidad.
Asimismo,
en el presente trabajo se observó que el T0 (0 ml de ANA) presento el más alto
porcentaje de protocormos fenolizados
(F) o muertos, esto concuerda con Gil & Gutiérrez (2016) quienes
indican que obtuvieron resultados que mostraron que el medio de cultivo sin la
adición de ANA (0 mg/l-1) se presentó el mayor porcentaje de muerte de protocormos, sin embargo reconocen que que la adición de
ANA en el medio de cultivo in vitro para generación de protocormos
y establecimiento de plántulas de Prosthechea
sp. obtuvo resultados diferenciales por lo que es
necesario realizar estudios exhaustivos para implementar su utilización en la
micropropagación de esta especie de orquídea.
Número de
hojas por protocormo. La Figura 5
muestra la prueba de Tukey (P<0,01) respectivamente para el número de hojas
por protocormo, datos transformados a Raíz cuadrada
(x).
Figura 5. Prueba de Tukey (P<0,01),
para el número de hojas por protocormo de Phragmipedium kovachii,
considerando el promedio general de las seis fechas de evaluación (cada quince
días), donde las letras diferentes difieren estadísticamente entre sí.
El análisis
de comparación de medias de Tukey (P<0,01) (Figura 5) para el número de
hojas por protocormo de plántulas de Phragmipedium kovachii,
muestra que el tratamiento T3 es el más sobresaliente de los tratamientos,
presentando 3 hojas por protocormo, seguido del
tratamiento T2 con 2 hojas por protocormo, en los
demás tratamientos no se encontró diferencias estadísticas significativas,
siendo, además, el T0 con 1 hoja, el que obtuvo el menor valor para esta
variable.
Los
resultados obtenidos difieren con los obtenidos por Gálvez (2005), quien
menciona que obtuvo poca diferencia entre tratamientos, en lo que respecta a
número de hojas, e indica que posiblemente el factor determinante para la
formación de brotes (desarrollo de hojas) y formación de raicillas sea la
incorporación de BAP y ANA a los medios de cultivo empleados ya que ambos
interactúan, aparte incluyendo otros reguladores de crecimiento que son
sintetizados por los protocormos, como lo sostiene Arditti (1990), que menciona que las auxinas (ANA) y
citoquininas (BAP)) actúan directamente en el desarrollo de las plántulas,
hojas e induce la salida de raíces, gracias a que las hormonas actúan en los
procesos fisiológicos y metabólicos específicos dentro de un órgano, siempre
con la ayuda de las condiciones ambientales brindadas en la cámara de
incubación.
Longitud de
protocormo. La Figura 6 muestra la prueba de
Tukey (P<0,01) respectivamente para longitud de protocormo
de Phragmipedium kovachii,
datos transformados a Raíz cuadrada (x).
Figura 6. Prueba de Tukey (P<0,01),
para la longitud de protocormo (cm) de Phragmipedium kovachii,
considerando el promedio general de las seis fechas de evaluación (cada quince
días), donde las letras diferentes difieren estadísticamente entre sí.
El análisis
de comparación de medias de Tukey (P<0,01) (Figura 6) para la longitud de protocormo de Phragmipedium
kovachii, muestra que el tratamiento T3 es el más
sobresaliente de los tratamientos, presentando 0,42 cm de longitud de protocormo, seguido del tratamiento T2 con 0,36 cm de
longitud de protocormo, en los demás tratamientos no
se encontró diferencias estadísticas significativas, siendo, además, el T0 con
0,26 cm de longitud, el que obtuvo el menor valor para esta variable.
Arditti (1982), menciona que existe
diferentes medios para especies de orquídeas, donde incluye en su composición
reguladores de crecimiento como son hormonas (en pequeñas cantidades estimulan,
inhiben o modifican cualquier proceso fisiológico), tales como auxinas, citoquinas, giberelinas, vitaminas
(biotina) que actúan sobre los vegetales, algunos actúan en forma rápida, otros
lo hacen menos rápido y otros impiden el normal desarrollo de la planta; así
mismo, Arditti (1990), menciona que las combinaciones
de auxinas y citoquininas puede favorecer el mejor desarrollo de las plántulas,
induciendo la formación de raíces, siempre y cuando el medio donde que se
emplea permita que interactúen los componentes, como también las condiciones
ambientales brindadas sean las adecuadas.
3.3
Fase de enraizamiento de plántulas de Phragmipedium kovachii
Número de
hojas por plántula. La Figura 7 muestra la prueba de Tukey (P<0,01)
respectivamente para el número de hojas por plántula de Phragmipedium
kovachii, datos transformados a Raíz cuadrada
(x).
Figura 7: Prueba de Tukey (P<0,01),
para el número de hojas por plántula de Phragmipedium
kovachii., considerando el promedio general de
las seis fechas de evaluación (cada quince días), donde las letras iguales no
difieren estadísticamente entre sí.
El análisis de comparación de medias de Tukey
(P<0,01) (Figura 7) para el número de hojas por plántula de Phragmipedium kovachii.,
muestra que no se encontró diferencias estadísticas significativas entre sí.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Cazarez et al. (2016),
quienes indican que al agregar BAP y ANA al medio de cultivo para multiplicar orquídeas,
observaron que para las variables número de hojas y raíces no se existieron
diferencias significativas entre los tratamientos. Sin embargo, Gálvez (2005), afirma
que, en su trabajo, la adición de ANA fue lo que permitió un mayor desarrollo y
permitió la salida de raíces.
Altura de
plántula. La Figura 8 muestra la prueba de Tukey (P<0,01)
respectivamente para la altura de plántulas de Phragmipedium
kovachii, datos transformados a Raíz cuadrada
(x).
Figura 8: Prueba de Tukey (P<0,01), para la altura de
plántulas de Phragmipedium kovachii, considerando el promedio general de las seis
fechas de evaluación (cada quince días), donde las letras iguales no difieren
estadísticamente entre sí.
El
análisis de comparación de medias de Tukey (P<0,01) (Figura 8) para la
altura de plántulas de Phragmipedium kovachii, muestra que no se encontró diferencias
estadísticas significativas entre sí.
Esto indica que no se requieren altas
concentraciones de auxinas para el crecimiento y desarrollo de las plántulas de
orquídeas, más bien se requiere tener en cuenta otros factores como la madures
de la semilla y el medio de cultivo que presente otros elementos disponibles
para la absorción por las semillas; esto se corrobora con lo que dice Muñoz
(2011) que en la especie de orquídea Epidendrum
jameisonic, consiguió incrementar el crecimiento
de las plántulas con la utilización de cápsulas verdes y con la utilización del
medio de cultivo compuesto por Murashigue & Skook ¼ + carbón activado 8 g/l.
Número de raíces por plántula. La Figura 9 muestra la prueba de Tukey
(P<0,01) respectivamente para el número de raíces por plántula de Phragmipedium kovachii,
datos transformados a Raíz cuadrada (x).
Figura 9. Prueba de Tukey (P<0,01), para el número de
raíces por plántula de Phragmipedium kovachii, considerando el promedio general de las seis
fechas de evaluación (cada quince días), donde las letras iguales no difieren
estadísticamente entre sí.
El análisis de comparación de medias de Tukey
(P<0,01) (Figura 9) para el número de raíces por plántula de Phragmipedium kovachii,
muestra que no se encontró diferencias estadísticas significativas entre sí.
Los resultados obtenidos indican que las
hormonas auxinas no influyen en el incremento del número de las plántulas de Phragmipedium kovachii.,
lo que concuerda con lo que dice Muñoz (2011), que altas concentraciones de
auxina inhibe el crecimiento de la raíz, más bien indica que la riboflavina
(B2) es necesaria para el crecimiento de la raíz y funciona reduciendo la
cantidad de auxina del sistema radicular, además Parra y Nates-Parra
(2007), quien reporta que las citoquininas también influyen inhibiendo el
desarrollo de raíces laterales. En cambio, Cazarez et al., (2016) indican que en al
adicionar auxinas y citoquininas al medio de cultivo para el número de hojas y
raíces no se observaron diferencias significativas.
Longitud de raíces por plántula. La Figura 10 muestra la prueba de Tukey
(P<0,01) respectivamente para la longitud de raíces por plántula de Phragmipedium kovachii,
datos transformados a Raíz cuadrada (x).
Figura 10: Prueba de Tukey (P<0,01), para la longitud
de raíces por plántula de Phragmipedium kovachii, considerando el promedio general de las seis
fechas de evaluación (cada quince días), donde las letras iguales no difieren
estadísticamente entre sí.
El análisis de comparación de medias de Tukey
(P<0,01) (Figura 10) para la longitud de raíces por plántula de Phragmipedium kovachii,
muestra que no se encontró diferencias estadísticas significativas entre sí.
Todo lo observado hace ver que la auxina no
incrementa la longitud de las raíces, más bien tal y como indica Muñoz (2011),
la alta concentración de auxina inhibe el crecimiento de la raíz y menciona que
la riboflavina (B2) es necesaria para el crecimiento de la raíz y funciona
reduciendo la cantidad de auxina del sistema radicular. Chacón et al.,
(2018) también indican que la adición de reguladores de crecimiento tales como
ANA, BAP y KIN al medio MS mostraron ser esenciales para el crecimiento,
desarrollo plantular de aspecto vigoroso y formación
de raíces.
Así pues del presente estudio realizado se
observa que hay mucho que investigar sobre la acción de las auxinas y
citoquininas en el desarrollo del embrión y los protocormos
en orquídeas tal y como afirma Yeung (2017) quien
afirma que, aunque la acción precisa de la auxinas y citoquininas no está clara durante el desarrollo de la
semilla y germinación, la información disponible indica que estas hormonas deben
desempeñar un papel importante en la formación del embrión y de los protocormos, lo cual falta investigar más a fondo.
4
Conclusiones
Se validó un protocolo para
la germinación de semillas de Phragmipedium
kovachii bajo condiciones in vitro, utilizando un medio de
cultivo propuesto por Gálvez (2005), con un pH modificado a 7,0; obteniendo un
60% de germinación.
En la fase de multiplicación
se observó que a mayor concentración de auxinas y citoquininas mayor es la
multiplicación de protocormos. En cambio, para la
fase de multiplicación se observó que no existe diferencias entre los tratamientos evaluados en
las diferentes etapas, lo que indica que las diferentes concentraciones de
auxina (ANA), no hizo ningún efecto sobre las plántulas de Phragmipedium
kovachii.
Agradecimientos
A la
Universidad Nacional de San Martín-Tarapoto, Facultad de Ciencias Agrarias y al
Instituto de Investigación y Desarrollo (IIyD) por el
impulso a la investigación y por el financiamiento del presente proyecto de
investigación.
Al
Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Facultad de Ciencias Agrarias
de la Universidad Nacional de San Martin – Tarapoto, lugar en el cual se realizó
el protocolo de multiplicación in vitro de Phragmipedium
kovachii de la presente investigación.
Al Instituto
de Investigación Biológica de las Cordilleras Orientales (INIBICO), quien nos
proporcionó el material vegetal (semillas de Phragmipedium
kovachii).
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