1.
Introducción
Plukenetia volubilis L. es un arbusto trepador
perteneciente a la familia Euphorbiaceae, oriundo de la cuenca Amazónica
de América Latina (Webster, 1994; Kumar et al., 2020). Durante la última década
esta especie ha adquirido gran importancia debido a la elevada concentración de
ácidos grasos insaturados tipo ácido α-linolénico (omega-3),
ácido linoleico (omega-6) y ácido oleico (omega-9) que le confieren un
potencial en el mercado nutracéutico, farmacéutico y alimenticio (Wang et al.,
2018; Kodahl, 2020). Sin embargo, su respuesta desfavorable a factores bióticos
como plagas y enfermedades como consecuencia de su limitada variabilidad
genética, ha llevado a tomar en cuenta estrategias para el mejoramiento
genético de este cultivo. Es por ello que se considera como alternativa el
empleo de la mutagénesis inducida como una vía para lograr este fin.
La mutagénesis
constituye una herramienta importante para la alteración de los genes y
ampliación de la variabilidad genética (Xu et al., 2017). El uso de agentes
mutagénicos, como el EMS, tiene un rol fundamental en este sentido (Porch et al.,
2009). EMS es considerado como el agente mutagénico más utilizado en programas
de mejoramiento genético para establecer grandes poblaciones de mutantes,
creando un alto número de mutaciones puntuales, en casi todas las especies de
plantas estudiadas (Krupa-Małkiewicz et al., 2017; Bayer, 2020). Además, ofrece
la posibilidad de incorporar cualidades que no pueden encontrarse en la
naturaleza o han desaparecido durante el proceso de domesticación (Novak &
Brunner, 1992; Kadhim, 2016). La frecuencia de mutaciones inducidas es
independiente del tamaño del genoma que presente la especie en estudio (Greene
et al., 2003).
Para el empleo
de agentes mutagénicos la optimización de las condiciones de inducción varía en
cada especie de planta, constituyéndose un paso crítico para el éxito de los
eventos mutagénicos (Padma & Reddy, 1977). En tal sentido, es necesario
determinar la dosis letal 50 (DL50), la cual se usará como criterio
para definir la dosis mutagénica óptima, que contribuyen al 50 de letalidad. La
determinación de DL50 es necesaria para producir una alta frecuencia
de mutaciones deseables (Hohmann et al., 2005; Arisha et al., 2014). El
procedimiento común para evaluar la dosis adecuada se basa en la comprensión de
la sensibilidad de los tejidos y/o células ante un agente mutagénico. La
concentración de EMS que produce un 50 de letalidad (DL50) se usa
como un indicador de alta frecuencia de mutación (Devi & Selvakumar, 2013).
En este
contexto, el empleo de EMS en semillas de P. volubilis representa una
alternativa viable para aumentar la diversidad genética, generando variantes
que permitan aumentar la base genética de esta especie. Sin embargo, la
concentración óptima y tiempo de exposición al agente mutagénico en semillas de
P. volubilis no ha sido investigado hasta la actualidad. Al respecto, el
presente estudio tuvo como objetivo i) Determinar la concentración óptima de
EMS en semillas de P. volubilis L., la cual reducirá la germinación y/o
emergencia de las semillas hasta un 50% (DL50) y ii) Evaluar las
alteraciones morfológicas y fisiológicas en plántulas de P. volubilis tratadas
con las diferentes dosis de EMS durante la primera generación.
2.
Materiales
y métodos
Colecta de material y tratamiento de semillas.
Las semillas de sacha
inchi (P. volubilis L.) del ecotipo Shanantina, fueron colectadas en un
campo agrícola ubicado en la provincia de Lamas, departamento de San Martín,
Perú, en el año 2017. Para el tratamiento con EMS fueron seleccionadas semillas
que presentaron características homogéneas en color: marrón oscuro, forma:
ovalada, tamaño: entre 1.5 a 2.0 cm de diámetro y ligeramente abultada en el
centro; todas estas características son importantes para garantizar la
uniformidad en la dosis recibida en cada tratamiento. Las semillas seleccionadas
presentaron un 85% de humedad antes de ser tratadas con diferentes dosis (0.0%,
0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% y 3.0%) de EMS en un solo tiempo de exposición (30 hrs.);
complementariamente, se utilizaron semillas si ningún tratamiento como control
absoluto. Por cada dosis, tres grupos de 50 semillas fueron tratadas con EMS en
forma independientemente. El contenido de humedad de las semillas se determinó
siguiendo la guía de International Seed Testing Association (ISTA, 2003) que se
basa en la diferencia entre el peso fresco y el peso seco de las semillas.
Siembra de semillas
Desde la cosecha en campo
hasta el tratamiento de semillas con diferentes dosis de EMS trascurrió un
periodo de 40 días; periodo óptimo para obtener un alto porcentaje de
germinación debido a que las semillas de sacha inchi posteriores a la cosecha
presentan un periodo de dormáncia que termina después de los 30 días. Para la
siembra de semillas tratadas se realizó un orificio de 1.5 cm. de profundidad
en cada bolsa almacigueras (1 kg.) y se colocó una semilla en posición
vertical, con el hilum orientado hacia abajo, esto para facilitar el
direccionamiento del meristemo radicular al germinar. De cada dosis, tres
réplicas de 50 semillas fueron sembradas en bolsas almacigueras conteniendo
suelo agrícola de textura franco arcillosa. Para la distribución de los tratamientos
se utilizó un Diseño Completamente al Azar (DCA).
Colección de datos
En condiciones de vivero
se evaluaron: porcentaje de emergencia durante los primeros 30 días después de
la siembra (DDS); la altura al ápice y variaciones morfológicas (dominancia
apical, forma de hojas y clorosis) se registraron 30 días después de la
emergencia (DDE) por cada tratamiento. Todas las evaluaciones realizadas están
validadas por el ISTA, 2003. Una plántula se consideró como emergidas cuando
supero el nivel del sustrato. Los ensayos en vivero fueron realizados bajo las
siguientes condiciones: temperatura (Tº mínima 21.4 °C, Tº media 29.0 °C y Tº
máxima de 38.2 ºC), humedad (Hº mínima 47.9%, Hº media 64.0% y Hº máxima de
73.8%). La noche la temperatura oscilaba entre 18 °C y 21 °C y la humedad 75%.
Análisis estadístico
Previo al análisis
estadístico los datos fueron sometieron al supuesto de normalidad para lo cual
se utilizó la dócima de Shapiro Wilk. Los datos de variables expresadas en
porcentajes se utilizó la transformación de Bliss o transformación angular
arcsen √x% (Snedecor & Cochran, 1980). Posteriormente las medias de las
variables estudiadas en el ensayo fueron sometidos a la prueba de Tukey con un
nivel de significancia de p<0,05 de probabilidad de error para determinar la
naturaleza de las diferencias entre tratamientos (Snedecor & Cochran,
1980). Los datos fueron analizados utilizando el programa estadístico InfoStat
(versión 2012e; Córdoba, Argentina)
3.
Resultados
y discusión
Emergencia de sacha inchi
El análisis de los datos
sobre el porcentaje de emergencia de semillas mostró que únicamente la dosis de
3% de EMS con un tiempo de exposición de 30 hrs. logró un 50% de emergencia. En
tanto las demás dosis (control, 0.0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% y 2.5%) de EMS
registraron entre 80.0% - 100.0% de emergencia, no presentando diferencias significativas
entre ellas (Figura 1). La dosis de 3% de EMS al causar un 50% de emergencia en
P. volubilis, podría ser considerada como la dosis mutagénica óptima que contribuye
al 50% de letalidad (DL50), lo que garantizaría una alta frecuencia
de mutaciones deseables como lo siguiere Arisha et al. (2014), Devi &
Selvakumar (2013), Ke et al. (2019) y Hohmann et al. (2005).
Figura 1. A) Emergencia de semillas
de P. volubilis tratada con 0% EMS, B) Semilla de P. volubilis tratada
con 3% de EMS, C) Efecto de diferentes concentraciones de EMS sobre la
emergencia de P. volubilis, medido 30 días después de la emergencia. Las
diferencias no significativas entre los tratamientos se muestran con letras
idénticas y se determinaron con el HSD de Tukey al nivel del 5%.
P.
volubilis
al presentar semillas con testa gruesa requieren un tiempo prolongado para que
consigan hidratarse completamente y germinar. En tal sentido, estudios
anteriores afirman que el proceso de mutagénesis requiere que el mutágeno sea
absorbido por el embrión en germinación y alcance la región meristémica donde
se encuentran las células germinales (Serrat et al., 2014); en este sentido, en
nuestro experimento no habría necesidad de un remojo y/o hidratación previa de
las semillas debido a que estas fueron tratadas con una solución de EMS durante
30 hrs.
La reducción
en la emergencia de las semillas de P. volubilis en la dosis de 3% de
EMS puede deberse a la inhibición de los procesos fisiológicos y biológicos que
se consideran necesarios para la germinación de las semillas, como la actividad
enzimática (Devi & Mullainathan, 2011; Kurobane et al., 1979), el desequilibrio
hormonal (Borovsky et al., 2013), e inhibición de procesos mitóticos
(Ananthaswamy et al., 1971; Kumar & Gupta, 2009) causados por el agente
mutagénico (EMS).
Asimismo, el
aumento de la dosis del mutágeno (EMS) incrementa la frecuencia del daño cromosómico
que puede ser responsable de la incapacidad de germinación y consecuentemente
su emergencia. Así mismo, estudios realizados por Bhat et al. (2012) mencionan
que el EMS reduce el crecimiento celular al inhibir la producción de ciertas
proteínas específicas y disminuye la producción de Auxina responsable de la
germinación. De igual modo, los resultados obtenidos por Prashant et al. (2015)
al tratar semillas de Brassica juncea con EMS, indicaron que la
germinación promedio disminuyó al aumentar la concentración de mutágeno.
Resultados semejantes también fueron observados en Capsicum annum por
Arisha (2014) y Devi & Selvakumar (2013).
Altura de planta y
dominancia apical
Se ha demostrado que
existe una dependencia lineal entre la altura de la plántula y la dosis de
mutágenos físicos o químicos, lo que convierte a este índice de medición como
el principal para identificar las influencias biológicas de los múgatenos
aplicados (Benjavad et al., 2012; Bhat et al., 2007; Devi & Mullainathan,
2011). Es así que nuestros hallazgos muestran que las disminuciones en la
altura de las plántulas se debieron a los aumentos en la concentración de EMS
(p<0.05), (Figura 2).
Figura 2. Efecto de diferentes
concentraciones de EMS sobre la altura de P. volubilis, medido 30 días
después de la emergencia. Las diferencias no significativas entre los
tratamientos se muestran con letras idénticas y se determinaron con el HSD de
Tukey al nivel del 5%.
La reducción
en la altura de P. volubilis se podría atribuir a la inactivación de
auxinas en la planta al aumentar la exposición a EMS (Ashok Kumar et al., 2009;
Kanakamanay, 2008), defecto en la biosíntesis de ácido giberélico (Fridborg et
al., 1999), cambios en el contenido de ácido ascórbico, trastornos fisiológicos
y bioquímicos generados por el mutágeno (Dhamayanthi & Reddy, 2000).
Asimismo, se conoce que los mutágenos pueden inhibir un sistema de suministro
de energía que resulta en la inhibición de la mitosis que puede estar asociada
con la depresión del crecimiento de las plántulas (Emrani et al., 2011).
En un estudio
donde se realizó el tratamiento de semillas de Capsicum annuum con
dosissuperiores al 1.25% de EMS, se observó una reducción significativa en la
altura de la planta, lo que puede considerarse un indicador de una mayor
frecuencia en las mutaciones (Arisha et al., 2014), en esta misma especie otros
investigadores como Alcantara et al., (1996), Jabeen & Mirza (2004) y
Lippert et al., (1964) registraron el mismo efecto. De igual forma, la altura
de la planta se redujo al aumentar las dosis de EMS en semillas de Vigna
mungo L. (Berenschot et al., 2008; Deepalakshmi & Anandakumar, 2004), Brassica
napus L. (Emrani et al., 2011), Triticum spp. (Bahar & Akkaya,
2009), Solanum licopersicum (Saba & Mirza, 2002), Zea mays
(Kumar & Kumar Rai, 2007) y Cicer arietinum (Shah et al., 2008).
De acuerdo a
lo mencionado anteriormente también podemos mencionar que las auxinas
desempeñan un papel vital en el desarrollo lateral y vertical de las plantas
(Hadebe et al., 2017). Como tal, la inactivación de estas enzimas debido a la
mutagénesis por EMS podría ser no solo la causa principal de las disminuciones
observadas en la altura de las plántulas, sino también la causa de la perdida
de dominancia apical en las plántulas. En nuestro experimento, los resultados
indican que conforme se incrementa la dosis del mutágeno (EMS), las plántulas
de P. volubilis tienen un mayor porcentaje de pérdida de dominancia
apical; prueba de esto se observó la presencia de uno o varios brotes laterales
en las plántulas que perdieron dominancia apical (Figura 3).
Figura 3. A) Meristema apical de
plántulas de P. volubilis de 20 días después de la emergencia (Control y
0% EMS), B-D) Inhibición de meristema apical y perdida de dominancia apical en
plántulas de P. volubilis 20 días después de la emergencia (3% EMS), C)
Efecto de diferentes concentraciones de EMS sobre la dominancia apical de P.
volubilis, medido 30 días después de la emergencia. Las diferencias no
significativas entre los tratamientos se muestran con letras idénticas y se
determinaron con el HSD de Tukey al nivel del 5%.
Clorosis
Las mutaciones de
clorofila se han utilizado ampliamente para evaluar la sensibilidad de
cualquier planta de cultivo a un mutágeno y la efectividad y eficacia relativas
de diferentes tratamientos mutagénicos (Wani et al., 2011). Los resultados
obtenidos en el presente estudio muestran que existe un mayor número de hojas
que presenten clorosis en plántulas de P. volubilis mutagenizada
conforme se incrementa la dosis de EMS (Figura 4).
Figura 4. Porcentaje de clorosis en
0,1, 2 y > 3 hojas de P. volubilis tratadas con diferentes dosis de
EMS, evaluado 30 días después de la emergencia. Las diferencias no
significativas entre los tratamientos se muestran con letras idénticas y se
determinaron con el HSD de Tukey al nivel del 5%.
Estudios anteriores informaron que el
desarrollo de la clorofila parece estar controlado por muchos genes que se
encuentran en diferentes cromosomas (Larkin & Scowcroft, 1981; Wang et al.,
2013). Por otro lado, la diferencia en la frecuencia y el espectro de las
mutaciones de clorofila depende de la interacción de tres factores: el genotipo
de la planta, el estado fisiológico del organismo en el momento del tratamiento
y el mutágeno utilizado (Chaudhan et al., 2015). Este efecto fisiológico
causado por la inducción de mutagenesis es importante para identificar la
función de los genes y el esclarecimiento del metabolismo de la clorofila y su
regulación (Wu et al., 2007).
En un estudio realizado
por Arisha et al. (2015), se observó un tipo de mutación visible en una planta
de Capsicum annuum que tenía un color amarillo verdoso uniforme, que
caracteriza la deficiencia de clorofila por efecto del mutageno utilizado
(EMS). También Girija & Dhanavel (2009) reportaron una alta frecuencia de
mutacion de clorofila tipo “viridis” por efecto del mutágeno químico (EMS) en Vigna
unguiculata. De igual forma, Chaudhari et al. (2015) encontró que la
biosíntesis de clorofila a y b se redujo notablemente en las generaciones M1 y
M2 con altas concentraciones EMS y Azida sódica en semillas de Psoralea
corylifolia
Deformación de hojas
La medición de daños
morfológicos en inducción de mutagénesis física o química es verificada por la
deformación de hojas en evaluaciones tempranas. La variación en la forma de la
hoja es una mutación común que puede darse debido a una mutación nuclear o citoplásmica.
El EMS puede tener una alta especificidad para los genomas mitocondriales y
plastídicos (Miller et al., 1984). En este estudio se pudo registrar un mayor
porcentaje de deformación de hojas en plántulas mutagenizadas a medida que se
incrementó la dosis del mutágeno EMS (P <0.05) (Figura 5).
Figura 5. A) Plántulas de P.
volubilis de 30 después de la emergencia (Control y 0% EMS), B-C) Plántulas
de P. volubilis de 30 después de la emergencia (3% EMS), C) Efecto de
diferentes concentraciones de EMS sobre la dominancia apical de P. volubilis,
medido 30 días después de la emergencia. Las diferencias no significativas
entre los tratamientos se muestran con letras idénticas y se determinaron con
el HSD de Tukey al nivel del 5%.
En otros estudios donde se
mutagenizó semillas de Capsicum annuum, se observó que la deformación de
la hoja fue común en todos los tratamientos, y se caracterizó por hojas con
anchura reducida, longitud normal, y nervio central y venas torcidas (Alcantara
et al., 1996). Del mismo modo, Dhakshanamoorthy et al. (2010) afirman que todos
los tratamientos de EMS aplicados en semillas de Jatropha curcas L.
revelaron un efecto inhibitorio en la longitud del pecíolo en comparación con
el control.
4.
Conclusiones
Las dosis de 3% de EMS con
un tiempo de exposición de 30 hrs., redujo hasta un 50% la emergencia de
plántulas de P. volubilis L., en ensayos de vivero. Así mismo,
registramos alteraciones fenotípicas como deformación de hojas, clorosis y
perdida de dominancia apical con el incremento de dosis mutagénica; siendo la
dosis de 3% recomendables para generar poblaciones mutantes en sacha inchi.
Agradecimiento
Al Laboratorio de Biología
y Genética Molecular de la Facultad de Ciencias Agrarias y al Instituto de
Investigación y Desarrollo (IIyD) de la Universidad Nacional de San Martín por
brindar la infraestructura, financiamiento y todas las facilidades para la
ejecución de la presente investigación.
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Financiamiento
Instituto de Investigación y
Desarrollo de la Universidad Nacional de la San Martín (UNSM-T), al Consejo
Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC), en el
marco del PROYECTO N° 187-2015-FONDECYT por el financiamiento y acompañamiento
en la ejecución de la presente investigación.
Conflicto de
intereses
El presente artículo no
presenta conflicto de intereses.
Contribución de autores
Corazon- Guivin, Mike: Asesoramiento,
planificación, conducción y redacción del manuscrito.
Arévalo-Rojas, Manuel: Apoyo en la
conducción del experimento y revisión del manuscrito
Acosta-Córdoba, Ronny: Apoyo en la
conducción del experimento y evaluaciones.
Chirinos-Hinojosa Danny: Apoyo en la
redacción del manuscrito.
Valverde-Iparraguirre, Jorge: Procesamiento
de los resultados y revisión del manuscrito.
Ruiz-Sánchez, María: Procesamiento de los
resultados y revisión del manuscrito.
Cerna-Mendoza, Agustín: Procesamiento de
los resultados y revisión del manuscrito.
Guerrero-Abad, Juan: Planificación del experimento
y revisión del manuscrito.
0000-0001-6027-4255]1; Arévalo-Rojas,
Manuel [